モノクローナル抗体産生CHO 細胞株の96-ウェルプレートを用いたフェドバッチ培養条件最適化の自動化

Abstract

近年、種々の疾患の治療に関し、モノクローナル抗体（mAb）など免疫グロブリン（IgG）が用いられるケースが増えています。mAb 産生プロセス開発には、培地の最適化、抗体生産性の向上に必要な細胞培養条件の特定など、多くの時間と労力を要する工程が伴います。細胞培養を用いた抗体生産にはフェドバッチ培養プロセスを用いて（細胞に）必要な栄養素を生理的条件下で供給します。高い抗体価を得るため、多くの場合、高性能の基礎培地をフィード液体培地や特定の細胞株に最適化されたフィードレジメンと組み合わせて使用します。培養条件の確立には、実験計画法（Design of　Experiments：DoE）を用いて、最適なフェドバッチ培地の組み合わせを、無作為抽出により統計的に決定する方法があります。DoE に基づいたワークフローでは、統計的に相関性のあるハイスループットな解析結果が得られるものの、時間がかかり、ミスが起こりやすいという欠点があります。

本アプリケーションノートでは、バイオ医薬品分野における治療薬開発に向けた細胞ベースのプロセス開発ハイスループット化について、96- ウェルプレートを用いた懸濁細胞培養の自動化と最小化について紹介します。ここに示すワークフローは、DoE の完全実施要因計画（2 水準）メソッドを用いて生成した、個々の異なるバッチフィードの組み合わせを採用しています。そして、IgG を生産するチャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary cells: CHO 細胞）株に使用される様々な基礎細胞培養培地を評価できます。次に、培地最適化実験の自動化ワークフローを設計することによって、手作業を減らし、ウォークアウェイ時間を増やしました。そして、培地最適化に要する時間を短縮し、フェドバッチ培地条件スクリーニングや生細胞のカウントおよびIgG 定量を自動で実施できました。

IgG 産生CHO 細胞株をForti-CHO 培地で培養し、各HyClone Cell Boost ™フィード用サプリメントを添加した条件で評価しました。基礎培地に、HyClone の組合せを培養0 日目より添加し、その後240 時間にわたり、細胞生存率測定とlgG定量を行いました。その後、解析対象のCell Boost をそれぞれの相対比率でフェドバッチ培地に添加しました。培地最適条件下とフェドバッチ培養条件下でmAb の抗体価が得られ、同等の抗体価が得られることが確認できました。このワークフローにより、DoE に基づいた、モノクローナル抗体産生プロセス開発のためのフェドバッチ培地条件スクリーニングのハイスループット解析を自動化することが可能です。

はじめに

近年、疾患の治療に、モノクローナル抗体（mAb）など免疫グロブリン（IgG）が用いられるケースが増えています。また、mAb 産生時に高い抗体価が得られるよう、処理能力を上げ、高効率で高度な細胞培養プロセス自動化に対する需要も拡大しています。mAb 産生プロセス開発には、培地の最適化、抗体生産性の向上に必要な細胞培養条件の特定など、多くの時間と労力を要するワークフローが伴います。細胞培養を用いた抗体生産にはフェドバッチ培養により必要な栄養素を生理的状態で供給します。高い抗体価を得るため、多くの場合、基礎培地にフィード培地を加え、特定の細胞株に最適化されたフィード培地の組み合わせで使用します。プロセス開発を加速し、効率よく最適化を行うには、合理的で高度な並列処理が可能な仕組みが必要です。

抗体価の高い生産を目的としたプロセス開発には、培地添加物のスクリーニング、培地の最適化、フェドバッチ培養の解析など様々なアプローチが必要です。特に高い抗体価の細胞培養条件特定に異なる細胞培養試薬や培地を組み合わせは重要です。実験計画法（DoE）のような厳格なメソッドを適用すれば、統計的かつ高い信頼性で、最適なフェドバッチ培養成分の組み合わせを、検証対象の要素を無作為にグルーピングして決定することが可能です。しかし、検証に必要な要素数が多くなると、DoE の組み合わせの検証に多くの手間とコストがかかり、データのばらつきも生じます。哺乳類細胞株のフラスコ培養には大量の培地が必要となるため、特にこの傾向が強くなります。例えば、日常的に用いる振とうフラスコ培養では、大量の培地（10mL～ 3 L）が必要です。したがって、独立変数の総数が制限され、検討条件が限られてしまい、有用な要素を除外してしまう危険性があります。

この問題を解決するため、DoE に基づいたフェドバッチ培養条件スクリーニングと培地最適化のための、バイオ医薬品プロセス開発をハイスループット化しました。そして、96- ウェルプレートを使用した懸濁細胞培養の自動化と最小化のためのシステムの設計を行いました。フェドバッチ培養条件の組み合わせは、DoE の完全実施要因計画（2 水準）を用いて作成し、IgG 産生チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary cells: CHO 細胞）株に使用される様々な基礎培養培地を用いて評価しました。次に、フェドバッチ培養条件スクリーニングや生細胞のカウントおよびIgG 定量を自動化できるよう、自動化ワークフローを設計し、培地最適化実験の手作業を減らすことでウォークアウェイ時間を増やし、培地最適化に要する時間を短縮しました。

本アプリケーションノートでは、96 ディープウェルプレートを使用したフェドバッチ培養条件スクリーニングを最適化するため、効率的な自動化ワークフローを検証します。本ワークフローでは、自動分注機（Biomek i7 ハイブリッドワークステーション）および自動セルカウンター（生死細胞オートアナライザーVi-CELL BLU）、SpectraMax i3 プレートリーダー、Kuhner 社製 shaker インキュベーターを統合して使用します（Figure 1）。このシステムにより、細胞や細胞培養培地の分注、フェドバッチ培養条件スクリーニング、添加物の組合せ、生細胞数の自動定量、Valita Titer システムを用いた生細胞のIgG 産生定量を含んだワークフローの全工程を自動化しました。さらに、Biomek が稼働中に、Biomek のデータ取得・レポートツール（Data Acquisition and Reporting Tool：DART）を用いることにより、自動データ追跡が可能となります。ログファイルからデータを収集してランタイムの情報を合成し、統合システム全体で実行される全ての操作を記録します。

Figure 1. IgG 産生細胞の培養スケールアップに必要な、マイクロプレートを用いた培養条件最適化のための要素技術

方法

DoE の完全実施要因計画に基づく培地最適化のための自動細胞培養条件

ヒトIgG1 を発現し、浮遊細胞培養に適合するよう改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞Agarabi CHO 株（ATCC cat# CRL-3440）を、1% 抗凝集剤と200 nM glutamaxを加えたGibco™CD FortiCHO（ ThermoFisherScientific cat# A1148301）基礎培地に播種し、Kuhner 社製インキュベーターを用いて、37℃、CO₂ 8% で培養しました。プロセス開発の検証のため、Cytive 社より購入したCell Boost 培地添加物を、事前にデザインしたDoE マトリックスを用いて評価しました（Figure 2A）。DoE マトリックスは、完全実施要因計画のアプローチによるJMPR ソフトウエアで作成し、5 つの要素（Cell Boost 1、2、3、7A、7B）について細胞培養培地を用いて検証しました（Figure 2A）。n=5 でDoE の完全実施要因計画（2 水準）を使って、32 のランダム変数が作成されます。この変数は、3 つの独立した生物学的反復（n=3）を使って評価するよう設計されています（Figure 2A-B）。Cell Boost と培地は、Cell Boost 培地添加物の総量が90 μ L となるよう1 : 1 の容量比で混合しました。細胞濃度0.5x10⁶ 細胞/mL になるよう細胞を播種し、各ランの細胞培養の総容量が700 μ L となるよう基礎培地を加えました。細胞培養インキュベーション中、プレート全体へ酸素を供給できるよう0.8mm の穴を開けた96-deepwell sandwich covers（Kuhner cat# SMCR1296c）で覆った滅菌済み96- ウェルディープウェルプレート（ベックマン・コールターライフサイエンス、製品番号：267007）で細胞を培養しました。細胞をKuhner 社製インキュベーターにより37℃、8% CO₂、回転振幅50mm、振とう速度225RPM でインキュベートしました（Figure 1）。細胞生存率は96-well サンプルプレートが使用できる生死細胞オートアナライザーVi-CELL BLU （ベックマン・コールターライフサイエンス、製品番号：C19196）で測定しました（Figure 1）。細胞を様々なタイムポイントで回収し、生細胞濃度とIgG 定量分析を実施ました。下流解析とモデリング評価のため、データをDoE JMPR ソフトウエアに保存しました。

自動細胞播種

Biomek ソフトウエアを用いて、自動化ワークフローを設計しました。開始時点（T₀）での細胞播種、Cell Boost 培地添加物の分注（Figure 2B）、生細胞数カウントのための細胞回収、Valita Titer kit（製品番号：VAL003）を用いたIgG レベルの自動解析が自動化のカギを握るプロセスです。Biomek による自動化メソッドで運転している間は、DataAcquisition and Reporting Tool （DART）が、エラー、ピペッティング、分注などメソッドによる操作の詳細全てを記録します（Figure 3A, 赤の矢印）。この設定によって、Biomek ソフトウエアは対応する全てのデータをログファイルへ記録することが可能です。このログファイルは、コピー＆ペーストの操作をしなくても、インテグレーションされた全てのシステムで閲覧することができ、ランの詳細はDART report builder で自動解析されます。

Figure 2. CHO 細胞内でのIgG 産生に対する5 種類のCell Boost 培地添加物の効果を評価するための、DoE 完全実施要因計画に基づいたマトリクス

ValitaTiter アッセイによる自動IgG 解析

Valita Titer （製品番号：VAL003）アッセイの自動化を、使用説明書に記載のプロトコルに沿って行いました²。液体分注ステップは、Biomek i7 ハイブリッドワークステーションによる自動化メソッドで行いました（Figure 3A）。まずアッセイバッファー（Forti-CHO）60 μ L を、96- ウェル黒色ValitaTiter プレートの各ウェルに添加し、システムに組み込んだOrbital Shaking ALP を用いて5 分間振とうしながらインキュベーションしました。ヒトIgG 抗体をForti-CHOバッファ中で100mg/L から1 mg/L に段階希釈して、標準曲線を作成しました。次に、標準曲線サンプルをValitaTiter アッセイプレートに添加し、5 分間振とうしました。最後に、システムに組み込んだ、蛍光偏光検出カートリッジを備えた SpectraMax i3x（Molecular Devices）にプレートを移し、暗所で3 分間インキュベートして偏光を測定しました。同じ手順で未知サンプルの解析を行い、培地を遠心により細胞培養サンプルから回収し、自動でValitaTiter 解析に供しました。解析のために、0、96、144 時間のタイムポイントでサンプル採取を行いました。

Figure 3. Biomek 自動化に使用したメソッドと、細胞播種、培地成分添加、IgG 定量を自動で行うための自動化装置のデッキレイアウト

結果と考察

Cell Boost サプリメントを添加したサンプルにおける細胞生存率

高い抗体価でのIgG生産を目的として培地最適化ワークフローの自動化を評価しました。最初にDoEに基づいたアプローチによりIgG 生産性の評価に必要となる培地添加物の組み合わせを特定しました（Figure 2B, 3A-B）。自動化メソッドでは、細胞播種、培地添加物の添加、生細胞濃度算出を行いました。異なる培地添加物を添加後の細胞生存率を、様々なタイムポイント（0 ～ 200 時間）で解析しました。0（開始）時点では、96 ディープウェルプレート6 枚それぞれに濃度0.5x10⁶ 細胞/mLで播種し、DoE のデザインに従ってCell Boost 培地添加物を加えました（Figure 2A-B）。同時に細胞のインキュベーションを開始し、24 ～ 48 時間ごとにプレートを1 枚回収して、その細胞生存率を測定しました。細胞を別のプレートでインキュベートし、異なるタイムポイントで解析しても、培地やスパイクしたCell Boost 培地添加物の種類で、細胞増殖率に一貫した再現性が認められました。5 つの培地添加物の増殖曲線は、それぞれの条件によって細胞増殖率が変動しました。この効果を詳細に精査するため、実験で用いた要素をグルーピングしてデータ解析を行いました。その結果、添加した培地添加物が1 種類のみのグループと基礎培地との比較では、増殖率に大きな違いは認められませんでした。

Cell Boost 培地添加物を2 種類添加した条件では、添加物の種類によって異なる結果が観察されました。具体的には、Cell Boost 1 と７Ｂを添加された細胞の増殖率が、２種類の添加物で処理された他のグループや基礎培地と比較して、低い結果となりました。3 種類以上のCell Boost 培地添加物を添加したグループでは、様々な条件でベースラインと同程度の細胞生存率が維持され、増殖率が向上しました（Figure 4E-F）が、2 つの条件では増殖率が低下しました（Figure 4F）。