OMIP-104 食事誘発性肥満マウスの肝臓組織免疫細胞構成の検討：公開されているOMIP パネルのスペクトルフローサイトメーター CytoFLEX mosaic システムへの適用
Joost M. Lambooij1, Tamar Tak1, Anisha Jose2, Fanuel Messaggio2
1Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands
2Beckman Coulter Life Sciences
はじめに
肥満誘発性慢性炎症（メタ炎症）は、代謝器官の免疫応答が変化することで起こり、脂肪肝疾患や2 型糖尿病の進行に関与します。このような肥満によって誘発される変化について研究することを目的に、マウスの肝臓と白色脂肪組織サンプルの免疫組成を調べることのできる30 色のスペクトルフローサイトメトリーパネルがすでに開発され、OMIP に公開されています[1]。このパネルは、代謝組織に元々存在する免疫細胞とリクルートされたマクロファージサブセットに注目し、マウス代謝組織における免疫状態の全体構造を把握することを目的とするものです。このパネルでは、クッパー細胞とリクルートされたマクロファージとを分離し、脂肪組織のマクロファージサブセットを同定します。また、マクロファージや樹状細胞の活性化状態のマーカーも含まれているため、代謝障害に関与する免疫細胞の詳細な解析が可能です。
本稿では、OMIP-104 をフローサイトメーターCytoFLEX LX mosaic システム* を用いた場合の性能を評価しました。具体的にはOMIP で公開されているパネルを変更なしで使用した場合に、スペクトル検出モジュールCytoFLEXmosaic への適用の容易さ、パネルのパフォーマンス、肝臓サンプル自家蛍光の処理能力について評価しました。
* フローサイトメーターCytoFLEX LX にスペクトル検出モジュールCytoFLEX mosaic を接続したスペクトルフローサイトメーター
材料
機器と消耗品
- フローサイトメーターCytoFLEX LX（ベックマン・コールター PN#C11186）（Table 1）
- スペクトル検出モジュール CytoFLEX mosaic 88（ ベックマン・コールター PN#D19581）（ Table 1）
- スペクトル解析ソフトウエア CytExpert for Spectral（ベックマン・コールター）
- Daily QC Fluorospheres （ベックマン・コールター PN# 65719）
- IR QC Daily QC Fluorospheres （ベックマン・コールター PN# C06147）
- クラウド型サイトメトリー解析ソフトウエアCytobank（ベックマン・コールター PN#C47384）
- 抗体についてはTable 2 をご参照ください。
- その他の材料については、参考文献１の「Supplementary」をご覧ください。
| 機器本体 | レーザー | スペクトル検出モジュール | 各レーザーにおける検出器数 |
|---|---|---|---|
| CytoFLEX LX |
Deep UV 355 nm Violet 405 nm Blue 488 nm Yellow 561 nm Red 638 nm IR 808 nm |
CytoFLEX mosaic 88 |
UV: 20個 Violet: 20個 Blue: 16個 Yellow: 12個 Red: 10個 IR: 3個 |
Table 1：フローサイトメーターおよびスペクトル検出モジュールの仕様
| Marker | Fluorochrome | Clone | Supplier | Catalog # | Titration | Conc. (μg/ml) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CCR2 | PE-Cy5 | SA203G11 | BioLegend | 150638 | 1:400 | 0.5 |
| CD3 | *BV750 | 17A2 | BioLegend | 100249 | 1:100 | 2.0 |
| CD4 | BV650 | RM4-5 | BioLegend | 100546 | 1:100 | 2.0 |
| CD8 | BV711 | 53-6.7 | BioLegend | 100748 | 1:200 | 1.0 |
| CD9 | *APC-Fire 750 | MZ3 | BioLegend | 124814 | 1:400 | 0.5 |
| CD11b | BUV563 | M1/70 | BD Biosciences | 741242 | 1:1600 | 0.125 |
| CD11c | BUV496 | HL3 | BD Biosciences | 750483 | 1:200 | 1.0 |
| CD19 | eFluor 450 | eBio1D3 | Invitrogen | 48-0193-82 | 1:100 | 2.0 |
| CD31 | BV605 | 390 | BioLegend | 102427 | 1:3200 | 0.0625 |
| CD36 | Biotin | HM36 | BioLegend | 102604 | 1:200 | 2.5 |
| Biotin | BV570 | Streptavidin | BioLegend | 405227 | 1:200 | 0.5 |
| CD45 | APC-Fire 810 | 30-F11 | BioLegend | 103174 | 1:1600 | 0.125 |
| CD63 | *Alexa Fluor 700 | NVG-2 | BioLegend | 143924 | 1:100 | 5 |
| CD64 | PE-Dazzle 594 | X54-5/7.1 | BioLegend | 139320 | 1:400 | 0.5 |
| CD90.2 | BV510 | 30-H12 | BioLegend | 140326 | 1:1600 | 0.125 |
| CD172a | *BUV805 | P84 | BD Biosciences | 741997 | 1:200 | 1.0 |
| CD206 | BV785 | C068C2 | BioLegend | 141729 | 1:200 | 1.0 |
| CLEC2 | FITC | 17D9 | Bio-Rad | MCA5700 | 1:400 | 0.25 |
| ESAM | BUV737 | 1G8 | BD Biosciences | 752446 | 1:800 | 0.25 |
| F4/80 | Spark NIR 685 | BM8 | BioLegend | 123168 | 1:1600 | 0.3125 |
| Ly6C | PerCP-Cy5.5 | HK1.4 | BioLegend | 128012 | 1:800 | 0.25 |
| Ly6G | *Spark Blue 550 | 1A8 | BioLegend | 127664 | 1:800 | 0.625 |
| MHC II | BUV395 | 2G9 | BD Biosciences | 743876 | 1:1600 | 0.125 |
| Neutral lipids | *LipidTOX Deep-Red | - | Invitrogen | H34477 | 1:400 | n/a |
| NK1.1 | PE-Fire 700 | S17016D | BioLegend | 156528 | 1:1600 | 0.125 |
| Siglec-F | BV480 | E50-2440 | BD Biosciences | 746668 | 1:400 | 0.5 |
| TIM4 | PerCP-eFluor 710 | RMT4-54 | Invitrogen | 46-5866-82 | 1:800 | 0.25 |
| TREM2 | *PE | 6E9 | BioLegend | 824806 | 1:100 | 2.0 |
| Viability | *Zombie NIR | - | BioLegend | 423106 | 1:1000 | n/a |
| XCR1 | BV421 | ZET | BioLegend | 148216 | 1:100 | 2.0 |
Table 2：抗体の詳細
注意：ここに示すデータは、Lyve-1 が発現していない肝組織サンプルのみから得られたものであるため、この試験ではLyve-1 PE-Cy7 は含まれていません。このマーカーは、脂肪組織の血管周囲マクロファージのゲートに使用されるもので、参考文献1 のFigure 1 に示されているように、肝臓ではそれ以外の役割を果たすものではありません。
- *Alexa Fluor（「AF」）は、Thermo Fisher Scientific Inc. の登録商標です。
- *Brilliant Ultraviolet (BUV) は、Becton, Dickinson and Company の登録商標です。
- *Brilliant Violet（「BV」）は、Becton, Dickinson and Company の登録商標です。
- *Spark Blue はBioLegend の登録商標です。
- *APC-Fire、*Zombie はBioLegend の登録商標です。
- *LipidTox はInvitrogen の登録商標です。
方法
OMIP‐104 に記載されているサンプルの調製および染色の方法を、本テストに用いた異なるコホートのマウスから採取したサンプルに適用しました。簡単に説明すると、サンプルは、60% Kcal 高脂肪食に1% のコレステロールを添加した西洋式食餌を与えた雄マウスの肝臓からソーティングしたCD45+ 細胞です。この試験では、6 匹のマウスの白血球をまとめてプールしました。.
サンプル調製、抗体染色、単染色コントロールの調製の評価方法の詳細については、参考文献１の「Supplementary」をご覧ください。
データの取得
- フローサイトメーターのスイッチがオンになっていること、ウォームアップされていること、メーカーおよび施設の指示に従って適切にクリーニングされていることを確認します。
- 精度管理を実行し、アンミキシングテンプレートの作成、実験サンプルのバッチ用Experiment テンプレートを作成します。
- Assay Settings を使用して実験サンプルを測定します。
結果と考察
スペクトルビューア
Figure 1：スペクトルビューア スペクトル解析ソフトウエアCytExpert for Spectral で生成された蛍光色素の組み合わせ。
類似性インデックス
Figure 2：類似性インデックス（Simillarlty Index） スペクトル解析ソフトウエアCytExpert for Spectral で生成した、このOMIP で使用されている蛍光色素の類似性インデックス。Complexity score は11.0。
ゲーティングストラテジー
Figure 3A は、このパネルで使用したマニュアルゲーティングストラテジーで、Figure 3B に示すFMOコントロールも用いて、肝臓サンプルの主要な白血球サブセットをゲートしています。免疫サブセットとその識別マーカーの詳細は、Table 3をご覧ください。
Figure 3：ゲーティングストラテジー A) データ取得の安定性を検証するためにタイムゲートを設定（画像は不掲載）後、デブリス、ダブレット、死細胞を最初に除外し、次に組織内の総白血球をCD45+CD31- として同定。その後、図示のとおりにすべての主要な免疫細胞ポピュレーションと関連するサブセットを同定。B）FMOコントロール。活性化マーカーLipidTOX Deep Red、CD63–AlexaFluor 700、CD9–APC-Fire750、CD36–BV570、CCR2–PE-Cy5、TREM2–PE をFMO を用いてゲーティング。サンプルは(A) で示すtotal Mph でプレゲートし、FMO はオレンジ、染色されたサンプルは青で示されています。プロットはCytobankで作成した。
注意：オリジナルのOMIP-104 ゲーティングストラテジーは、「B 細胞と好中球を最初に除外し、その後CD64 vs F4/80 でゲーティングしてマクロファージを同定し、CD64 とF4/80 ダブルネガティブからCD11b vs NK1.1 でゲーティングしてNK 細胞を同定する」というプロセスでした。本実験ではこのアプローチを変更し、ゲーティングストラテジーを調整しました。変更後のアプローチでは、「B 細胞と好中球を最初に除外し、NK 細胞をCD11b vs NK1.1 をゲートして除外した後、CD64 vs F4/80 でゲーティングすることにより、NK1.1 陰性からマクロファージを同定」します。このゲーティング戦略の調整は、最終データには影響しません。透明性の維持、OMIP-104 ゲーティングストラテジーの正確な再現を可能にするため、また比較研究や方法論の一貫性の検証に必要な場合のため、ここに記します。
| Population | Markers |
|---|---|
| Total leukocytes | CD45+CD31- |
| Eosinophils | CD45+Siglec-F+ |
| ILCs | CD45+Siglec-F- CD90.2+CD3- |
| NK T cells | CD45+Siglec-F- CD90.2+CD3- NK1.1+ |
| CD4 T cells | CD45+Siglec-F- CD90.2+CD3- NK1.1- CD4+ |
| CD8 T cells | CD45+Siglec-F- CD90.2+CD3- NK1.1- CD8+ |
| Neutrophils | CD45+Siglec-F-CD90.2- Ly6G+ |
| B cells | CD45+Siglec-F- CD90.2- CD19+ |
| Total macrophages (Mph) | CD45+ Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19- CD64+ F4/80+ |
| Kupffer cells | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64+ F4/80+CD11blowCLEC2+ |
| Pre-monocyte-derived Kupffer cells | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64+F4/80+CD11b+ CLEC2intermediate |
| Monocyte-derived macrophages | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64+F4/80+CD11b+ CLEC2- |
| Monocyte-derived Kupffer cells | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64+F4/80+CD11blowCLEC2+ TIM4- |
| Resident Kupffer cells | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64+F4/80+ CD11blowCLEC2+ TIM4+ |
| NK cells | CD45+Siglec-F- CD90.2- CD19-CD11b-NK1.1+ |
| Ly6Chigh monocytes | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1- CD11b+ MHC-II- Ly6Chigh |
| Ly6Clow monocytes | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1- CD11b+ MHC-II- Ly6Clow |
| Transitional monocytes | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1-CD11b+ MHC-II+CD64intermediate |
| Dendritic cells | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1-CD11b+MHC-II+ CD64-CD11c+ |
| cDC1s | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1-CD11b+MHC-II+CD64-CD11c+XCR1+ CD172a- |
| cDC2 | CD45+Siglec-F-CD90.2-Ly6G-CD19-CD64-F4/80-NK1.1-CD11b+MHC-II+CD64-CD11c+XCR1- CD172a+ |
Table 3：肝組織中の免疫細胞ポピュレーション一覧
自家蛍光除去とアンミキシング
スペクトルアンミキシングのための単染色コントロールのほとんどは、パネルの全蛍光色素のスペクトルと一致するように、細胞を用いて作製されました。しかしいくつかのマーカーでは、細胞ではその色素のスペクトルが綺麗に得られませんでした。例えば、自家蛍光スペクトルが強く、FSC/SSC だけでは区別が困難な好酸球にのみ発現するマーカーであるSiglec-F – BV480 にはビーズを用いました。BV480 では、ビーズを使用した方がスペクトルの決定が容易でした。未染色サンプルのプールからは、4 つの自家蛍光ポピュレーションを同定しました（Figure 4）。
本測定では、アンミキシングの過程で4 種類の自家蛍光固有スペクトル（自家蛍光シグネチャー）を除去すると、１種類の自家蛍光シグネチャーだけで自家蛍光除去をした場合と比較して、アンミキシングエラーが減り、分解能が向上することが示されています（Figure 5 A-B）。Figure 5 から、複数種類の自家蛍光シグネチャーの抽出が、アンミキシングの正確性の向上に重要であることがうかがえます。
Figure 4：未染色コントロールから同定した自家蛍光を有する複数のポピュレーションの自家蛍光スペクトル スペクトルはスペクトル解析ソフトウエアCytExpert for Spectral で生成。
Figure 5：複数の自家蛍光シグネチャーでのスペクトルアンミキシング A) 同一サンプルを１種類の自家蛍光シグネチャーを用いてアンミキシングした例。B）4 種類の自家蛍光シグネチャーを使用して除去した例。プロットはFigure 3A のtotal leukocytes プレゲート。プロットはCytobank で作成。
スペクトル検出モジュールCytoFLEX mosaic に搭載されているアンミキシングアルゴリズム
スペクトル検出モジュールCytoFLEX mosaic には、2 つのアンミキシングアルゴリズムが搭載されています。1 つは一般的に用いられている最小二乗法（LSM）、もう1 つは、スプレッドエラーの懸念が大きい複雑なパネルの解像度を改善するためにポアソン（Poisson）アルゴリズムを改良したものです。これら両方のアンミキシングアルゴリズムを実際に使ったうえで、特定のパネルの解析にはどちらが最適かを判断するとよいでしょう。
OMIP-104 は慎重に設計されたパネルであり、どの蛍光色素の組み合わせも類似度指数は0.84 以下のため、スプレッドエラーのリスクは最小限と考えられます(Figure 2)。これらのアルゴリズムが細胞同定の解像度に与える影響を比較するため、Cytobank でopt-SNE マップを作成しました。Figure 6 に示したデータから、どちらのアンミキシングアルゴリズムを用いても、このパネルが細胞ポピュレーションを定義、分離する性能は、同じであることがわかります。
Figure 6：マニュアルゲーティングオーバーレイ on opt-SNE マニュアルゲーティングで同定したポピュレーションをopt-SNE マップ上にオーバーレイ表示。同一サンプルのtotal Leukocyte ポピュレーションをLSM（左）またはポアソン（右）でアンミキシング。
考察と結論
OMIP-104 はマウス代謝器官の免疫細胞サブセットを解析するための堅牢なツールであり、様々な組織や特定の白血球サブセットの研究へも容易に適用できます。私たちはこのパネルをスペクトルフローサイトメーターCytoFLEX mosaic システムに適用し、Figure 3 に示すように、すべての主要な白血球ポピュレーションとそのサブセットの同定に成功しました。このパネルは元々CytoFLEX mosaic 用に設計されたものではないため、タイトレーションおよび実験設定の最適化によってパネルのパフォーマンスをさらに向上させることができた可能性があります。例えば、現行のパネルには808 nm 近赤外線レーザー用の蛍光色素は含まれていませんが、このような蛍光色素を加えることで、パネルの拡張や、スプレッディングエラーの原因となる蛍光色素との入れ替えを容易にします。これは、他の機器での抗体パネルをCytoFLEX mosaic に自信を持って適用するための信頼できる方法です。
略語
| 略語 | 正式名称 |
|---|---|
| APC | アロフィコシアニン |
| BUV | ブリリアントウルトラバイオレット |
| BV | ブリリアントバイオレット |
| Cy | シアニン |
| FITC | フルオレセインイソチオシアネート |
| IR | 赤外 |
| ILCs | 自然リンパ球 |
| Mph | マクロファージ |
| NIR | 近赤外 |
| NK | ナチュラルキラー |
| PE | フィコエリスリン |
| PN | 製品番号 |
| QC | 精度管理 |
| TIM4 | 膜タンパク質TIM4 |
| TREM2 | 骨髄細胞-2トリガー受容体２ |
| XCR1 | X-Cサイトカイン受容体１ |
参考文献
- Lambooij JM, Tak T, Zaldumbide A, Guigas B. OMIP-104: A 30-color spectral flow cytometry panel for comprehensive analysis of immune cell composition and macrophage subsets in mouse metabolic organs. Cytometry. 2024;105(7):493–500.
コンベンショナル＆スペクトルフローサイトメーター
CytoFLEX mosaic システム
クラウドプラットフォームサイトメトリー解析ソフトウエア
Cytobank
