ウイルスベクターの特性評価

細胞並びに遺伝子療法では、治療用遺伝子を輸送するベクターを利用して、生体内に治療用遺伝子を導入します。 遺伝子治療を手がけている企業の多くは、この治療用遺伝子を輸送するベクターとしてアデノ随伴ウイルス（AAV）を使用しています。AAVが理想的なベクターである理由としては、ウイルスのキャプシドを遺伝子操作により改変することで治療用遺伝子を病変した細胞に効率よく運ぶことができるためです。
ウイルスの研究者は、まず欠損のない完全な治療用遺伝子が導入されたウイルスカプシドが何パーセント存在しているのか、つまりその存在比率を把握すること、そして次に、このウイルスカプシドがどれくらいの量存在しているのか、つまり定量的に把握することが必要と考えています。このような遺伝子組換えウイルスキャプシドは遺伝子治療を成功に導くのに重要です。

empty capsid, partial capsid, full capsid the ultimate goal viral vector characterization with auc

欠損のない完全な治療標的遺伝子を含まないウイルス粒子は治療効果が低いだけでなく、これらの不完全なキャプシドは免疫原性反応などの副作用を引き起こす可能性があるため、これらの粒子のウイルス量を把握しておくことは、研究者にとって極めて重要です。 研究者は、実験によって得られたウイルス精製品の品質並びに純度を把握する必要があり、この品質や純度を洞察することができる超遠心分析法に注目しています。

遺伝子組換え型AAV(rAAV)ベクターの均一性、純度（それ以外の物性情報）を測定するためのソリューション：ウイルス粒子の水溶液中での分析

遺伝子組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（rAAV）は、多くの人の命を救うことができる新たな遺伝子治療ツールとして大きな可能性を秘めています。

動的光散乱法（DLS）または高速液体クロマトグラフィー法（HPLC）などの古典的な分析手法では、rAAVベクターの不均一性ならびに凝集物に対する特性評価は可能ですが、データ分解能が高くないため、rAAVベクターの均一性ならびにウイルス粒子の量の定量化などの解析ができません。また臨床段階でのrAAVベクター製剤の製造において、障害の１つとして、常に高い分解能でのrAAVベクターの特性評価を実現することがあります。

遺伝子治療の研究者の誰もが知っているように、臨床段階の製剤の製造工程の初期の開発では多くの問題があり、開発がうまく進まないことはよくあります。 しかし、超遠心分析法を導入することにより、従来の分析法で達成することができなかった常に高い分解能でのrAAVベクターの特性評価を実現できるため、臨床段階でのrAAVベクター製剤の製造工程開発を推進することができます。

製造工程開発の障害となっていた主な要因とは何か？ つまり、以下の分析項目に対して、製剤の品質がモニタリングでき、高い分解能でかつ定量性のある分析技術がなかったからです。

  • 均一性
  • 純度
  • 再現性
  • ウイルスの遺伝子量

理想的なソリューション：超遠心分析法（AUC）によるウイルス粒子の水溶液中での分析

Genethon社の研究者らは、精製したrAAVベクターを担体などのマトリックスフリーの状態で、ウイルスの血清型や導入された治療遺伝子の種類にかかわらず、ウイルス粒子を水溶液中で特性評価できることを見出しました。 具体的には、AUCによって次のことがわかります。

  • ウイルス粒子の会合状態や均一性の決定
  • 凝集物の定量化
    • 不完全なウイルス粒子の混入比率
  • 内包された遺伝子量の異なるウイルス粒子の正確な定量

Genethon社のChristine LE BEC博士と彼女のチームが、AUCを活用して、どのようにscAAVベクターおよびssAAVベクターの特性評価（均一性や内包された遺伝子量の異なるウイルス粒子量）に成功されたのかをお知りにたい方は、こちらのWEBセミナーをご覧ください。

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Analytical Methods to Measure Empty and Full AAV Particles

As gene therapy approaches usually require large amounts of AAV vectors for clinical use, few manufacturing processes have been reported to provide high titer and potent quantities of products. The dose control of AAV vectors is commonly established on titration methods relying either on the quantitation of DNA (viral genome) or transgene expression following cell transduction (infectious genome). However, AAV vector lots are generally a heterogeneous mixture of empty particles (i.e. do not contain DNA) and full particles (i.e. contain DNA). Therefore, it could be considered that empty particles are product related impurities, which can impact on the immunogenicity profile of the product when high doses are administered to patients. Different indirect methods can be used to establish the ratio between full and empty AAV particles. The quantification of full capsids is performed by using qPCR based technology. The total particles can be evaluated by an ELISA assay, spectrometric analysis, ion-exchange chromatography or SDS-PAGE. However, these methods have limitations and are not applicable to all serotypes without performing a new development. Using analytical ultracentrifugation approach, we have developed a method to quantify simultaneously empty and full AAV particles as well as intermediate species containing fragmented or incomplete vector genome. We have applied this technique to AAV lots of different serotypes, several sizes of transgene and different process of production. Several examples of AAV vectors analysis will be presented showing that AUC could be implemented as a routine test to monitor AAV product quality and manufacturing consistency.

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