蓮沼 誠久 先生
松田 真実 先生

神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科

バイオモノづくりは、持続可能な社会の実現に向けた革新的なアプローチとして、ますます重要性を増しています。微生物を利用した研究開発は、環境負荷を低減し、資源の効率的な利用を可能にする新たな知見が発見できる一方で、微生物の菌数や体積の精確な測定は、研究成果の信頼性や再現性を確保するために欠かせない要素となっています。

一般的に、微生物の菌数を計測する菌数計測法には、コロニーカウント法や濁度法などがありますが、簡便な測定手法である一方で、測定精度や測定で得られる情報の少なさなど、いくつかの課題があります。

コールター法を原理とするコールターカウンター（Multisizer 4e）は、微生物の菌数、サイズ（分布）、体積、濃度などの項目を短時間で高精度に計測できる特徴から、濁度法だけでは捕えきれない「培養時間と共に微生物体積が変化する」微生物の経時的なモニタリングにおいても、使用されています。

そこで、本インタビューでは、神戸大学 蓮沼研究室で取り組んでおられる研究内容や、松田先生の取り組まれておられる研究テーマについてお聞きし、バイオモノづくり分野における微生物の菌数・体積測定の重要性と、貴研究室におけるコールターカウンター（Multisizer 4e）の有用性についてお聞きいたしました。

ご研究内容について

① 蓮沼研究室で取り組んでいる研究内容に関してご教示ください。

私たちの研究室では、主に二酸化炭素を資源として利用する微生物等を対象に、持続可能なバイオものづくりの研究を進めています。特に、微生物を用いたカーボンリサイクル技術の開発に力を入れており、再生可能資源からバイオプラスチックや有用化合物を生産するための代謝工学・システム工学的な研究に取り組んでいます。

② 松田先生が取り組まれているご研究のテーマについてご教示ください。

私の研究テーマは、Cupriavidus necator H16という細菌を用いて、増殖とポリヒドロキシアルカン酸（PHA）生産の関係を精密に解析し、バイオプラスチック生産を最適化する手法を確立することです。Cupriavidus necator H16はCO_₂を炭素源、水素をエネルギー源として増殖できる微生物で、環境に優しい素材生産に活用が期待されています。

バイオモノづくり分野における微生物の菌数・体積測定の重要性について

① 微生物の菌数・体積を測定する重要性について、ご教示ください。

微生物研究において、菌数と体積の精確な測定は、生育状態と代謝産物の関係を理解するために不可欠です。特に、増殖と物質生産が競合する系では、濁度計だけでは把握できない「いつ増殖が止まり、いつ代謝産物の蓄積が始まるのか」を正しく捉える必要があります。菌数・体積測定は、その転換点を明確にし、効率的な生産プロセス設計に直結する重要な指標となります。

ご研究におけるコールターカウンターの有用性について

① Multisizer 4eを使用する前は、どのように微生物の菌数・体積計測を行っておられるかご教示ください。

Multisizer 4eを導入する以前は、光学濁度（OD₆₀₀）の測定や、血球計算盤を使った手動による細胞数測定、乾燥重量（DCW）の測定、さらにガスクロマトグラフィー（GC）によるPHA定量を用いていました。

OD測定はリアルタイムに行えるため便利でしたが、菌体サイズや内部構造の変化に影響を受けやすく、PHA蓄積のある菌では正確に菌数を反映しませんでした。また、血球計算盤による細胞数測定は比較的正確に行えていましたが、全ての細胞を目で見て数える必要があるため時間を要します。

GC分析は、PHA含量を直接的かつ高精度に定量できる最も信頼性の高い手法です。ただし、測定までに乾燥や加熱処理など複雑な前処理を必要とし、クロロホルムや硫酸といった有害試薬を扱うなど、安全面や作業負荷の課題がありました。このため、GC法は高い定量精度を有する一方で、リアルタイムでの培養モニタリングには適さないという側面があります。結果として、正確性・迅速性・安全性のいずれも同時に満たす手法の確立が求められていました。

② Multisizer 4eを使用する前の測定方法で、微生物の菌数・体積計測の際に感じていた課題についてお聞かせください。

従来法で最も大きな課題は、「リアルタイム性の欠如」と「誤解を生むデータ」でした。濁度測定では、菌数が増えていなくてもPHA蓄積により光散乱が増加するため、見かけ上は菌数が増えているように誤認する危険がありました。

また、GCによる正確なPHA定量は可能でしたが、測定までに長時間を要し、培養の状態をその場で把握することはできませんでした。これにより、培養の転換点を逃す、培養条件の調整が遅れるといった問題が生じていました。

図1. 微生物が産生物を体内に蓄積した顕微鏡画像
（左）培養初期の細胞　（右）PHAを蓄積した細胞

コールターカウンター（Multisizer 4e）について

①「コールターカウンター Multisizer 4e」での測定についてお聞かせください。

Multisizer 4eを導入したことで、菌数と体積を短時間で同時に測定できるようになりました。これにより、増殖が停止しても体積が増加する現象を捉え、PHA蓄積との関連を明確に示すことができました。GC法がPHA定量において最も高い精度を提供する「直接的評価法」であるのに対し、コールターカウンターは、培養過程を迅速かつ簡便にリアルタイム評価できる補完的な手法として大きな利点があります。

試料の前処理もほとんど不要で、そのまま培養液からデータを取得できるため、培養中の経時的変化を継続的に追跡することが可能です。

得られるデータは再現性が高く、増殖段階から生産段階への切り替えを客観的に把握できるようになりました。このように、GC法とコールター法はそれぞれ「正確さ」と「リアルタイム性」という異なる強みを持ち、両者を組み合わせて活用することで、より信頼性の高い培養解析が可能になります。

図2. 光学濁度（OD）およびセルカウントに基づく細胞増殖の評価
細胞体積を反映しているODが上がる一方、細胞分裂が止まっている様子をリアルタイムに把握することができます。
複数のサイズのアパチャーが複数用意されていて、細胞サイズに合ったものを選択できるところも利点です。

図3. ガスクロマトグラフィーによるPHA定量と体積の比較
Multisizer 4eで測定した細胞体積と、ガスクロマトグラフィーで測定したポリマー生産量に相関が見られました。

② バイオものづくり研究でまだまだ認知度の低いコールター法の有効性と将来性に関するご意見や、ベックマン・コールターやMultisizer 4eに関する要望など教えてください。

コールター法は、微生物の菌数と体積を直接かつ高精度に測定できる数少ない方法です。バイオものづくりの分野では、依然として濁度計測が主流ですが、内部に物質を蓄積する微生物では誤差が大きく、研究や産業利用の信頼性を損なう要因となります。今回の研究を通じて、コールター法が培養プロセスを客観的かつリアルタイムで評価できる有効な手段であることを実感しました。特に、変異株のスクリーニングや培養条件の最適化において、その効果は大きいと考えています。

今後は、フローサイトメトリーや画像解析技術と組み合わせることで、より高精度なオンラインモニタリングが可能となり、産業スケールでの自動制御システムにも応用できると期待しています。将来的には、コールター法が「微生物研究の標準ツール」として広く普及していくことを望んでいます。

図4. 微生物を濁度計とMultisizer 4eで測定したデータ
（増殖曲線を比較して相関性の違いを示したデータ・微生物体積の経時的変化を示したデータ）
（左）濁度計　（右）Multisizer 4e