BioLector XT マイクロバイオリアクターを使った Chlorella vulgaris の光照射培養

はじめに

バイオプロセスエンジニアリング技術の発達により、微細藻類によるエネルギーや貴重な化合物生産の可能性を探索できるようになりました¹。近年、藻類バイオテクノロジーに対する関心の高まりは、バイオ燃料生産、二酸化炭素隔離および環境バイオレメディエーションへの微細藻類の利用を著しく進歩させ、バイオマス、食品、栄養補助食品および医薬品の原料として、藻類の大きな可能性が明らかになってきています²。

さらに、微生物細胞工場としての藻類の利用は、食料・エネルギー危機のような最も緊急性の高いグローバル課題に対する解決策のひとつであり³、持続可能なバイオエコノミーへの移行を促進します⁴。微細藻類のバリューチェーンは、産業規模での潜在的な収益性と競争力が期待できますが、バイオリファイナリーは、生物学的可能性、プロセスルートおよび市場ニーズに合わせて適応させる必要があります^{5, 6}。

培養条件や株スクリーニング、株操作の向上は商業化をする上で重要なステップです⁷。例えば、短縮型のクロロフィルでのアンテナサイズの減少により、太陽から生成物へのエネルギー変換効率を最大化することができます⁸。マイクロウェルを用いた培養装置は、微生物細胞および哺乳類細胞の短時間かつ初期段階のスクリーニングが行える強力なツールであり⁹、従属栄養微細藻類のバイオプロセス開発で、すでに利用されています¹⁰。

最適な独立栄養または混合栄養培養条件を検討するためにはマイクロフォトバイオリアクター（μPBR）システムが必要ですが、従来装置では一連の技術からは程遠く、さらなる改善（特に調節可能な照明の改善）が不可欠でした^{11, 12}。

このアプリケーションノートでは、マイクロバイオリアクターBioLector XTに高度な光照射モジュールと、専用のフィルタモジュールを搭載することにより、最大48のマイクロウェルでのパラレルな光合成培養と、バイオマス、クロロフィル濃度、pHなどの重要な培養パラメータのオンラインでの非侵襲的な測定が可能になりました。光照射モジュール（Light Array Module：LAM）は、必要な光合成スペクトルで の正確かつ多様な照射方式が可能です。スペクトルは柔軟に対応でき、個別に制御できる計16種類のLEDによって、最大4,000 μmol/m²/s付近での照射ができます。

Figure 1. LAM搭載マイクロバイオリアクターBioLector XT

Chlorella vulgarisは光栄養、従属栄養および混合栄養にて生育でき¹³、市販されている主要な微細藻類の1つで、年間約5,000トンのバイオマスが生産されています¹⁴。C. vulgarisは汎用的な培養条件で 高い成長速度を示し、様々な研究により、C. vulgarisが産生する生化学成分に多くの用途があることが明らかになっています¹⁵。C. vulgarisはタンパク質含量が高く、ヒトの栄養に関して世界保健機関（WHO） が提案する値と極めて類似したアミノ酸プロファイルを持っています。さらに必須栄養素が含まれていることから、食品および飼料産業で様々な用途に利用されています¹⁵。さらに、好ましくない成長条件では C16およびC18脂肪酸が蓄積することから^{16, 17}、廃水処理施設にてバイオ燃料を生産できる可能性もあります¹⁵。

Figure 2. マイクロバイオリアクターBioLector XTで光独立栄養培養したChlorella vulgaris

このアプリケーションノートでは、LAMを搭載したマイクロバイオリアクターBioLector XTがC. vulgarisの光独立栄養培養に適していることを示します。また、重要な培養パラメータをオンラインでモニタリングできる複数のフィルタモジュールを用いた検証も行いました。

方法

フィルタモジュールの開発

重要な光合成培養パラメータをオンラインモニタリングするため、複数のフィルタモジュールを設計し、検証を行いました。

バイオマス：散乱光を用いたバイオマス測定に関して¹⁸、クロロフィル色素の干渉を回避するため、クロロフィルの吸収スペクトル外（>700 nm）のバイオマス測定用フィルタモジュールを開発しました¹⁹。C. vulgarisの希釈系列に対してこれらのフィルタモジュールのキャリブレーションを行いました。

クロロフィル含量：クロロフィル蛍光を用いてクロロフィル濃度をオンラインで定量しました。標準クロロフィルaおよびb（Sigma-Aldrich）をDMSOに溶解し、複数のフィルタモジュールをクロロフィルaおよびbの希釈系列に対してテストしました。また、バイオマスに対するクロロフィル蛍光のキャリブレーションを行いました。

pH：オプトードを用いたpH測定²⁰は、オプトードが光退色するため、連続照明下では使用できません。その代わり、可溶性蛍光pH指示薬である8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸トリナトリウム塩（HPTS）を用いて光学的なpH測定を行うことができます^{21, 22}。HPTSによるpH測定はレシオメトリックな性質を持つため、2波長を同時に測定するために2種類のフィルタモジュールを開発しました。

HPTSはそれぞれ405 nmと455 nmの励起波長で、蛍光波長520 nmにおいてpH依存性の蛍光強度を示します。強度比IR（式1）はpH 0 ～ 14の範囲で安定ですが²¹、事前のキャリブレーションなしにpH値を計算することはできません²²。キャリブレーション結果をボルツマン方程式に当てはめることにより、キャリブレーションパラメータであるpH₀、dpH、I_R,minおよびI_R,max（式2）を計算することができます²³。

設計したフィルタモジュールを用いて検量線を作成し、マイクロバイオリアクターBioLector XTでのHPTSによるpH測定を評価しました。また、光退色に対するこの方法の感受性を、典型的な光合成培養条件で検証しました。

Chlorella vulgaris

Göttingen大学のCulture Collection of Algaeから純粋培養のChlorella vulgarisを入手しました（SAG株番号211-11b）。

培地

培養は、栄養強化Bold基本培地（enBBM）を適応させた培地を用いて、pH 6.5に調整しました^24-27。

培地は、MES緩衝液 9.76 g/L、NaNO₃ 1.5 g/L、K₂HPO₄ 0.6 g/L、KH₂PO₄ 1.4 g/L、MgSO₄ ·7 H₂O 187.5 mg/L、NaCl 6.25 mg/L、CaCl₂ · 2 H₂O 125 mg/L、FeSO₄ · 7 H₂O 9.96 mg/L、 H₂SO₄ 3.68 mg/L、Na₂EDTA · 2 H₂O 100 mg/L、KOH 62 mg/L、ペニシリンGナトリウム10 mg/L、微量元素液 20 mL/Lで構成しました。

微量元素液の組成は、ZnSO₄ · 7 H₂O 17.64 mg/L、MnCl₂· 4 H₂O 2.88 mg/L、Na₂MoO₂ ·2 H₂O 2.4 mg/L、CuSO₄ · 5 H₂O 3.14 mg/L、CoSO₄ · 7 H₂O 0.94 mg/L、H₃BO₃ 22.8 mg/Lでした。

マイクロバイオリアクターBioLector XTでの培養では、HPTS原液を、最終濃度が0.1 mg/L HPTSになるように培地に添加しました。

振盪フラスコでの培養

前培養物を振盪フラスコに入れ、25°C、180 rpm、振盪直径50 mmのインキュベーター中で培養しました。光合成を可能にするため、インキュベーションチャンバーの側面の1つにLEDモジュールを設置し、 綿栓を使用して培養液へのガスの移動ができるようにしました。LEDモジュールは、疑似太陽光LEDストリップ（LUMITRONIX LED-Technik GmbH）8個が並列に並んだものを使用しました。照度は、マイクロバイオリアクターBioLector XTでの培養中の照度と一致するよう、200 μmol/m²/sに設定しました。

マイクロバイオリアクターBioLector XTでの培養

培養は、フラワー（マイクロタイター）プレート（ 製品番号：M2P-MTP-48-B²⁸）中で、初期細胞濃度 5.5×10⁶ 個/mL、培養容量 1 mLで実施しました。光合成中の二酸化炭素と酸素のガス交換を可能にする ため、マイクロタイタープレートをガス透過性シーリング用ホイル（製品番号：MTP-F-GPRS-48-10）でシールしました。光照射モジュールは、約200 μmol/m²/sの光束密度で400 ～700 nmの疑似太陽光スペクトルが放射されるように設定しました（Figure 3）。

Figure 3. 培養中の照射スペクトルと照度設定

培養パラメータを800 rpm、25°C、85%相対湿度に設定し、空気と2% CO₂の混合ガスを用いて10 mL/minの流量で流しました。

結果

フィルタモジュールのキャリブレーション

バイオマス：開発した730、750および850 nmのバイオマスフィルタは、OD₇₅₀が0.3以上25以下の範囲で優れたキャリブレーション結果を示しました。730 nmモジュールの結果をFigure 3に示します。また、標準クロロフィルaおよびbに対する干渉も検出されませんでした。

Figure 4. C. vulgaris希釈系列に対する730 nm散乱光フィルタモジュールのキャリブレーション

クロロフィル含量：クロロフィルのキャリブレーションの結果から、開発したフィルタモジュールはクロロフィルaとbをそれぞれ同時に検出できることが示されました（Figure 5）。

Figure 5. クロロフィルa（黒）とクロロフィルb（赤）の希釈系列に対するクロロフィル蛍光フィルタモジュールのキャリブレーション

クロロフィル蛍光は、光合成培養物のバイオマス測定によく利用されます^{29, 30}。このことから、希釈バイオマス系列を用いたキャリブレーションを行いました。指数関数的減衰式に当てはめたところ、低バイオマス濃度で優れた分解能が観察されました（Figure 6）。

Figure 6. OD₇₅₀=2までのバイオマスに対するクロロフィルフィルタモジュール（λex = 450 nm、λem = 700 nm）のキャリブレーション

キャリブレーションの結果から、クロロフィル蛍光フィルタでバイオマス濃度（特に低バイオマス濃度）を正確に測定できることが確認できました。

pH：pHフィルタモジュールのキャリブレーションを、0.1 mg/L HPTSを含有するpH 5 ～ 10の緩衝液（Merck、Darmstadt, DE）を用いて25°C、30°C、35°Cおよび40°Cで行いました。優れたキャリブレーション結果（Figure7）から、ここに示した方法を用いてオンラインで正確にpHを測定できることが確認できました。

Figure 7. ボルツマン方程式に当てはめたpHに対する強度比IRのキャリブレーション

ここに示した方法が光退色に対して非感受性であることを確認するため、200 μmol/m²/sの典型的な培養条件を使用し、細胞を含まないenBBMを用いて、マイクロバイオリアクターBioLector XT中で 実験を行いました（Figure 8）。

Figure 8. 典型的な培養条件下でのHPTSによる光学的pH測定 (n=3)

実験開始時にはCO₂濃度上昇により培地が急速に酸性化（約0.05 pH）されますが、その後、少なくとも130時間測定値は一定でした（Figure 8）。このことから、培養条件、特に連続照明下で、数日にわた り正確で安定したHPTSによるpH測定が可能であることが証明されました。

マイクロバイオリアクターBioLector XTでのパラレル光合成培養

次に、長時間の培養を開始し、上記のフィルタモジュールのうち4つ、すなわち730 nmの散乱光モジュール、クロロフィル蛍光フィルタモジュール（λex = 450 nm、λem = 700 nm）およびレシオメトリックpH測定のための両HPTSフィルタモジュールを用いてオンラインでモニターしました（Figure 9）

Figure 9. 光照射モジュールと組み合わせたマイクロバイオリアクターBioLector XTでの16日間培養中の散乱光、クロロフィルおよびpH

Figure 9から、CO₂供給を停止するまでの約16日間、バイオマス濃度が連続的に上昇していることが分かり、5つの異なる成長期が確認できます。まず、遅滞期と指数関数的な成長期（I）がみられ、その後、 特徴的な3つの直線的な成長期（II ～ IV）がみられた後、CO₂枯渇後の死滅期（V）がみられます。pHとクロロフィルシグナルの推移は、観察された成長期と相関があります。実験全体を通じた散乱光シグナル の平均変動係数は5.2%であり、示したセットアップにてパラレルでの光合成培養が可能なことが分かりました。オフラインサンプルによってオンラインシグナルの正確性を確認しました。大気中のCO₂濃度への 短時間の曝露によるpH上昇がみられる235時間後のサンプルのオフラインOD₇₅₀値は40、オフラインpHは7.3となり、オンラインで測定されたpH 7.2と良好に相関していました。実験終了時のオフラインOD₇₅₀値は約60であり、高いバイオマス濃度に到達したことが示されました。

結果

Light Array Moduleの追加によって、BioLector XTの新しい境地が開かれました。このアプリケーションノートでは、重要な光合成培養パラメータであるバイオマス濃度、クロロフィル含量およびpHを正確に モニターできる複数のフィルタモジュールを紹介しました。

クロロフィル蛍光フィルタモジュールは、低濃度でのバイオマス測定の分解能に優れており、十分に高い細胞密度において正確な測定法である散乱光によるバイオマス測定を補完することができます¹⁸。さらに、HPTSによるpH測定は、連続照明下においても、オプトード測定に代わる優れた方法であることが示されました。

Chlorella vulgarisの長時間培養にて、本システムのマイクロリットルスケールのハイスループットなパラレルフォトバイオリアクターとしての可能性を示すことができました。また、開発したフィルタモジュールによって、細胞増殖に関わるオンライン情報が得られ、複数の異なる成長期が確認できました。

これらの結果により、複数の方法および多数の用途に対して光合成培養を最適化するためのプラットフォームを示すことができました。また、光照射モジュールの設計によって、異なる照射方式で幅広いスペクトルおよび照度範囲を設定し、それにより最適な照明条件を見つけることも可能です。これらの照明の設定は、藻類の成長に影響を与えることが広く報告されています^{12, 31-35}。

マイクロバイオリアクターBioLector XTでは光合成培養における重要なパラメータであるシステム内の実験雰囲気ガスを、ガス流量とガス組成により変化させることができます。例えば、CO₂を増やすとバイ オマス濃度は高くなります^{15, 33}。微細藻類の培養に影響を及ぼすその他の重要な要因として、温度^{36, 37}、pH^{15, 34}、塩分³⁸、炭素源^39-41、窒素源^{33, 39}および培地組成⁴²などがありますが、BioLector XTシステムは、これらの全てのパラメータを最適化することができます。

また、流加培養は脂質生産性を改善できるとされています⁴³。藻類の遺伝子操作の可能性は、規制上の制限により、研究されているだけでほとんど実生産に応用されていませんが、成長速度や細胞密度を上げ、生産速度または力価を高め、頑健性を強化し、太陽からバイオマスへの変換効率や光合成生産性を向上できる可能性があります^{1, 8, 44, 45}。

これらのファクターのいずれもマイクロバイオリアクターBioLector XTとLAMの組み合わせを用いて最適化でき、藻類の可能性を探求する研究をさらに加速させることができます。

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