Avanti JXNによるタンパク質精製ワークフロー

X線結晶構造解析、NMR、質量分析、in vitroの生化学的アッセイなど、多くのプロテオミクスアプリケーションにおいて、精製されたタンパク質が必要となる。組織中のタンパク質を単離することもできるが、より一般的には、細菌や酵母、哺乳類細胞といった培養細胞に過剰発現させたものを単離することが多い。アミノ酸組成、サイズ、形状、等電点、溶解性など、各タンパク質に固有の特性を利用して、目的のタンパク質を単離するユニークな戦略が開発されている。このような戦略において目指すべきは、目的の機能性タンパク質をなるべく多く分離し、その他の夾雑物をできる限り少なくすることである。

タンパク質の精製プロトコルにおいて、遠心分離は、多くの場合最初に行う重要なステップである。Avanti JXNシリーズには、タンパク質精製のあらゆる段階で利用できるロータが揃っている。この遠心機は、容量と遠心力をさまざまな組合せで持つロータを選ぶことができるため、プロテオミクスに取り組んでいるあらゆる研究室のニーズに対応できる汎用性の高い装置となっている。細胞のペレット化、タンパク質の沈殿、細胞内物質および膜の分離、密度勾配、タンパク質の濃縮など、多様なプロテオミクスアプリケーションに対応できる優れたソリューションを提供する。

Figure 2

  1. サンプル回収:タンパク質精製の第1ステップは、目的のタンパク質を精製するサンプル(例えば、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、組織など)をペレット化することである。通常このステップでは、低速だが高容量のロータが必要となる。Avanti JXNシリーズには、6リットルまでのボリュームに対応可能な固定角ロータJLA-8.1000/JLA-9.1000/JLA-10.500が揃っており、この用途に適している。JCF-Z連続フローロータであれば、バイオプロセシング実験で必要とされる、さらに大きなボリュームでのペレット化操作にも使用可能である。
  2. ライセートの清澄化:細胞をペレット化および溶解した後に行う、タンパク質精製の重要な第2ステップは、タンパク質を非タンパク質成分および細胞残渣から効率的に分離することである。このステップでは、高速で清澄化を行う方法を使用する。このステップで必要となるロータは、高速かつ高容量のロータである。Avanti JXNシリーズには、JA-25.15、JA-25.50、JA-30.50Tiといったさまざまなロータがあり、このステップに必要な100,000 ×gを超える遠心を行うことができる。
  3. 粗精製:硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等の沈殿剤を用いた沈殿分離ステップは、粗抽出物から全タンパク質を回収できるため、一次精製の方法として用いられる。この沈殿分離には、中程度の速度に対応した低容量から中容量のロータが必要となる。Avanti JXNシリーズには、このステップに適した速度と容量を併せ持つJA-17、JA-18、JA-20およびJLA-16.250などのロータが揃っている。
  4. クロマトグラフィーカラム:目的タンパク質の二次精製に使われることが多いのは、アフィニティ、イオン交換、疎水性、サイズ排除といったクロマトグラフィーの原理をベースにした方法である。マイクロ遠心用スピンカラムおよび96ウェルキットを使用することで、少量の組換えタンパク質を迅速かつ簡単に精製することができる。このようなカラムは、理想的なクロマトグラフィー条件の検討や、ハイスループットなプロテオミクス研究に最適である。JS-5.3およびJS-5.9ロータは、96ウェルフォーマットのタンパク質調製用カラムに対応している。
  5. 密度勾配法:密度勾配法は、ミトコンドリアや細胞膜から特定のタンパク質を単離する必要がある場合に、このような細胞小器官や膜構造を分離するためによく用いられている。また密度勾配法は、タンパク質調製の三次精製ステップとしても使用される。JS-24.15およびJS-24.38ロータは、レートゾーナル法および等密度遠心法の両方に対応している。
  6. バッファ交換および濃縮:プロテオミクスアッセイでは、適切なバッファの使用および高純度でのタンパク質濃縮が不可欠である。バッファ交換やタンパク質濃縮に使用できるさまざまなフィルターベースのカラムが市販されており、JS-4.0、JS-4.3およびJS-5.3には、これらの濃縮装置に対応したアダプタが複数用意されている。
Figure 3
注意:最大速度および容量は、アダプタ、ラボウェア、装置のモデルによって異なる場合がある。正確な情報については、該当するロータ/装置のマニュアルを参照のこと。

CENT-IAPP03.14-A

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