Ⅲ. 直接免疫蛍光法 (ヒト全血)2-4
2.Wash
(4)OptiLyse C ベックマン・コールター社フローサイトメーター用溶血試薬(Wash)
サンプル処理 1~10カラー解析(FITC/PE/ECD/PC5/PC7/APC/APC A700/APC A750/PB/KO)
1. 準備 測定する患者検体ごとに試験管(12×75mm)を測定項目数+1本用意し、1本にコントロール、残りに抗体名をラベルします。 |
|
2.抗体の添加*1 抗体名をラベルした試験管に各抗体を規定量*1加えます。コントロールの試験管には、調べたい抗体に対応するアイソタイプコントロールを加えます。 |
|
3. 検体の添加*2 全血100μL*2を加え、よく攪拌します。 |
|
4. インキュベーション 室温(20~25℃)、暗所で15~30分インキュベーションします。 |
|
5. 溶血の添加 OptiLyse Cを500μL加え、 よく攪拌します。 |
|
6. インキュベーション 室温(20~25℃)、暗所で10分インキュベーションします。 (2時間までインキュベーション可能です。) |
|
7. PBSの添加 PBSを500μL加え、 よく攪拌します。 |
|
8. インキュベーション 室温(20~25℃)、暗所で15分インキュベーションします。 |
|
9. 洗浄 PBSを2mL加え、 よく攪拌します。 400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。 ※ 遠心・洗浄のポイント! |
|
10. 測定 PBS500μLに再浮遊後、測定まで2~8℃で遮光保存し、なるべく速やかにフローサイトメーターで測定してください。 すぐに測定できない場合は、0.5%パラホルムアルデヒドPBS 500μLに再浮遊し、24時間以内に測定してください。 |
- 1テストあたりの抗体規定量
COULTER CLONE:使用前に5μLに血清加 PBS195μLの割合で希釈し、200μLご使用ください。
CYTO-STAT:10μL
OptiClone:20μL
IOTest:20μLまたは10μL
*必要に応じて、抗体使用濃度検討を行う場合は、規定量をもとにガイドライン(Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):291-308)に従ってください。 - 白血球数が3~10×103/mm3である検体を用いてください。
検体の白血球数の調整は、『Ⅱ.試薬・材料および検体』の①ヒト全血の項( 2.検体 )をご参照ください。