アポトーシスの検出（アネキシンV）

アネキシンV/7-AAD

  • 蛍光パラメータはログスケールを用います。
  • 蛍光補正が必要です。
  • ポジティブコントロール細胞が必要です。

アポトーシス（プログラム細胞死）はFas（CD95）シグナル、放射線や薬剤によるDNAの損傷、増殖因子の枯渇などさまざまな要因により誘導されますが、DNAの断片化と核および細胞の形態変化に至る以前に、ICEファミリープロテアーゼの活性化や、ミトコンドリア膜電位の低下などが認められることも明らかにされています。
アポトーシスをフローサイトメトリーで検出する方法として、各DNA染色によるSub-G1 フラクションの検出や、TUNNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法による断片化DNAの検出などが知られています。これらはアポトーシスの分子機構における中・後期のイベントを見るものですが、今日ではこのDNA断片化よりも以前に起こる、細胞膜の 構造変化を検出する方法が注目されています。
ここでは、アポトーシスの初期段階を検出するAnnexin V アポトーシス検出キットおよびTUNEL法をフローサイトメトリーに応用させたMEBSTAIN アポトーシス検出キットの使用方法をご紹介いたします。



原理

【Annexin V 】

細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）と結合する蛍光標識Annexin V とDNA に結合するPI や7-AAD（膜透過性がない）を用いてアポトーシス細胞を検出する方法です。
＊ここではPI を使用した例をお示しします。

  1. アポトーシスを誘導していない正常な状態の細胞は、細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）が存在しています。また、細胞膜の損傷もないのでPI は細胞内に取り込まれず核内DNA とは結合しません（図.1 - ①）。
  2. 細胞にFas 抗体または薬剤などを作用させることにより、アポトーシスを誘導させます。
  3. アポトーシスの初期の段階では、通常細胞膜の内側に存在するPS が細胞膜表面に露出してきます。このPS とAnnexinV はCa2+ 存在下で結合します。この段階の細胞膜にはまだ損傷が起こっていないため、PI は細胞内に取り込まれず、核内DNA とは結合しません（図.1 - ②）。
  4. 後期のアポトーシス細胞およびネクローシス細胞は、Annexin V とPI の両方に染まります（図.1 - ③）。

図.1 Annexin V 染色原理



アポトーシス誘導例

アポトーシスの誘導 ①　－Fas抗体によるアポトーシスの誘導－

Ⅰ. 準備

細胞： Jurkat 細胞

試薬： Fas(CD95)抗体（IM1504）：in vitro でCD95 を発現している細胞株のアポトーシスを誘導します。
    注： Fas 抗体(IM1504)の濃度は500 μg/mL です。
   RPMI 1640 または DMEM
   FCS
    注： RPMI 1640、DMEM およびFCS は、弊社では取り扱っておりません。

Ⅱ. 方法

Fas(CD95)抗体（IM1504 を使用する場合）

  1. Jurkat 細胞を、5×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
  2. この培養細胞に対してFas(CD95)抗体を100 ng/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
    例：培養細胞 20 mL Culture に、上記抗体を4μL 加えます。
  3. 37℃、CO2 5.0%で4～8 時間インキュベートします。
    （この反応時間の場合、20%～50%の細胞にアポトーシスが誘導されます。）

＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。



アポトーシスの誘導②　－薬剤（Actinomycin D）によるアポトーシスの誘導－

Ⅰ. 準備

細胞： Jurkat 細胞またはHL-60 細胞

試薬： Actinomycin D-Mannitol （SIGMA #A 5156 など）
   ストック溶液：SIGMA #A5156 をActinomycin D-Mannitol が1 mg/mL になるように
   蒸留水（無菌にしたもの）に溶解します。
   （溶解したものは、遮光をして4℃に保存します。）
   RPMI 1640 または DMEM
   FCS
    注：RPMI 1640、DMEM およびFCS は、弊社では取り扱っておりません。


Ⅱ. 方法

Actinomycin D-Mannitol（SIGMA #A 5156 を使用する場合）

  1. Jurkat 細胞またはHL-60 細胞を、5×105cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
  2. この培養細胞にActinomycin D-Mannitol（上記ストック溶液）を2 μｇ/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
    例：培養細胞 20 mL Culture に上記ストックを40 μL 加えます。
  3. 37℃、CO2 5.0%で 6～8 時間インキュベートします。
    （この反応時間で、60%～80%の細胞にアポトーシスを誘導します。）

＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。



アポトーシスの誘導③　－薬剤（Mitomycin C）によるアポトーシスの誘導－

Ⅰ. 準備

細胞： Jurkat 細胞

試薬： Mitomycin C (SIGMA #M 4287 など)
   RPMI 1640 または DMEM
   FCS
    注：RPMI 1640、DMEM およびFCS は、弊社では取り扱っておりません。


Ⅱ. 方法

Mitomycin C(SIGMA #M 4287 を使用する場合）

  1. Jurkat 細胞を、2×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
  2. この培養細胞にMitomycin C を1 μg/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。
  3. 37℃、CO2 5.0%で12 時間インキュベートします。
    （この反応時間で、40%～50%の細胞にアポトーシスを誘導します。）

    4. ＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。



2 カラー染色例

Annexin V Kit 【AnnexinV-FITC kit (PI)、Annexin V-FITC/7-AAD Kit】の場合

アポトーシスの特徴として、良く知られている DNA の特殊なフラグメント化の前に、細胞膜の構造変化が起こります。
通常、膜の内側に存在する膜リン脂質 フォスファチジルセリン（PS）は、膜の構造は保ったままで膜の外部に露出してきます。
露出したPS とAnnexin V は、カルシウムイオンの存在下で結合します。アポトーシスの起こった細胞では、Annexin V-FITC の蛍光は観察されますが、細胞膜の構造は保たれているため、PI/7-AAD は膜を通過できず、DNA とは結合しません。
一方、アポトーシスの後期やネクローシスの場合には、細胞膜の構造が崩壊しているため、Annexin V-FITC とPI/7-AAD の両方の蛍光が観察されます。また、正常な細胞はいずれの試薬とも反応せず陰性となります。


Ⅰ. 準備

器具： プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
   FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など）

試薬： Annexin V-FITC Kit (PI) （IM2375 20T または IM3546 200T）
   Annexin V-FITC/7-AAD Kit （IM3614 150T）


Ⅱ. 染色方法の流れ：2 カラー染色


＊バインディングバッファの代わりに、メディウムにCaCl2（終濃度1.5 mM 以上）を加えたもので代用できます。

Ⅲ. セットアップに必要なサンプル

① ： PI 単染色サンプル
② ： Annexin V-FITC 単染色サンプル
③ ： Annexin V-FITC とPI 染色サンプル(測定サンプル)



解析の流れ

解析例 【AnnexinV-FITC Kit(PI)】の場合

1. プロット図の作成
 SS / FS のプロット図と生細胞集団を囲むＡゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定をしたFL1 / FL4 のプロット図とゲートなしのFL1 / FL4 のプロット図の二つを作成します。



 

2. ネガティブコントロールサンプル
 ネガティブコントロールサンプルはPI で単染色したサンプルを用います。Ungate のプロット図で、PI 陽性細胞の感度設定を行います。また、このPI 陽性サンプルで、FL1 側のネガティブ領域を決定します。

（注）：PI を加えるとPI と細胞の非特異的な結合などによりバックグランドが上がります。PI を添加していないサンプルを用いてFL4 の感度調整を行た場合、PI を添加したサンプルのネガティブ（生細胞）の集団がFL4 軸側に浮き上がった状態になりますので注意してください。




3. FL4(PI)からFL1 への蛍光補正
 ネガティブコントロールサンプル(PI 単染色)を用いて、FL4 からFL1 への蛍光補正を行います。蛍光補正は、PI 陽性細胞が確認しやすいUngate のFL1 / FL4 プロット図で行います。




4. FL1(FITC)からFL4 への蛍光補正
 AnnexinV-FITC で単染色されたサンプルで、FL1 からFL4 への蛍光補正を行います。
ネガティブコントロールサンプルと違いPI が添加されていないため、PI の非特異的な反応が大きいサンプルではFL1 の軸にへばり付いた状態になることがあります。その場合、正確は蛍光補正が行えない事があります。
その時にはAnnxin V-FITC、PI 共に染色したサンプルを用い、A Gate が設定されたデータで蛍光補正を行ってください。




5. サンプル測定例



 サンプル測定例 ： Jurkat 細胞 5x106 cells/mL に対し、Actinomycin D-Mannitol を終濃度2 μｇ/mL になるように加え、6 時間インキュベートした後に測定したデータです。



3 カラー染色例（細胞表面抗原とアポトーシス検出）

Annexin V Kit 【 Annexin V-Biotin Kit】の場合

 Annexin V-Biotin を使用することにより、Annexin V-Biotin と結合する蛍光色素を自由に選択することが出来ます。ここでは表面抗原を2 つの蛍光色素て染色し、Annexin V-Biotin をストレプトアビジン（SA）が修飾された蛍光色素で染色する3 カラー染色方法をご紹介します。

Ⅰ. 準備

器具： プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
   FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など）

試薬： Annexin V-Biotin Kit （IM2585 20T または IM2586 200T）
   蛍光標識ストレプトアビジン
   蛍光標識抗体


Ⅱ. 染色方法の流れ：3 カラー染色

＊バインディングバッファの代わりに、メディウムにCaCl2（終濃度1.5 mM 以上）を加えたもので代用できます。


3 カラー（細胞表面とアポトーシス）解析の流れ

3 カラー染色解析例

今回使用した 3 カラー染色サンプルはCD5-FITC、CD1a-PE、Annexin V-Biotin/SA-PC7 を用いて測定しました。

1. プロット図の作成
 SS / FS のプロット図の感度調整を行い、Ａゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定がされた各パラメータのプロット図を作成し感度調整を行います。




2. FL1(FITC)からFL2(PE)、FL1(FITC)からFL5(PC7)への蛍光補正
 FL1(FITC)からFL2(PE)、FL1(FITC)からFL5(PC7)への蛍光補正をFITC 単染色サンプルを用いて行います。




3. FL2(PE)からFL1(FITC)、FL2(PE)からFL5(PC7)への蛍光補正
 FL2(PE)からFL1(FITC)、FL2(PE)からFL5(PC7)への蛍光補正をPE 単染色サンプルを用いて行います。




4. FL5(PC7)からFL1(FITC)、FL5(PC7)からFL2(PE)への蛍光補正
 FL5(PC7)からFL1(FITC)、FL5(PC7)からFL2(PE)への蛍光補正をPC7 単染色サンプルを用いて行います。




5. サンプル測定例







接着細胞染色例

Annexin V Kit 【 Annexin V-Biotin Kit】の場合

Ⅰ. 準備

器具： 24wel プレート
   ゴム製のスクレーパー
   FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など）

試薬： Annexin V-Biotin Kit （IM2585 20T または IM2586 200T）
   蛍光標識ストレプトアビジン


Ⅱ. 接着細胞染色方法の流れ


＊バインディングバッファの代わりに、メディウムにCaCl2（終濃度1.5 mM 以上）を加えたもので代用できます。



【MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit （TUNEL 法）】

原理

MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Dirrect /ⅡはTUNEL 法により、DNA の断片化を指標として、アポトーシスによる細胞死を細胞個々に検出する試薬です。細胞内の核における断片化DNA の3’-OH 末端部分にfluorescein-dUTP を結合させることにより、断片化DNA に特異的な蛍光を検出できます。

図.2 TUNEL法染色原理

■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct
dUTP がFITC 標識されているため、染色の工程が少なく、簡便に染色できます。

■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ
dUTP がBiotin 標識されているため、dUTP の検出をするための蛍光色素を自由に選択することができ、好きな染色の組み合わせを選択できます。

MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct, MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱは株式会社 医学生物学研究所（MBL）で取り扱ってます。

MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct ：MBL code 8445、MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ：MBL code 8441


■MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct FCM 解析データ

Jurkat 細胞を抗ヒトFas 抗体(クローンCH-11)でアポトーシスを誘導しました。抗体添加２時間後、及び、４時間後に細胞を回収し、MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct で染色し、フローサイトメーターで測定しました。

データ提供：株式会社 医学生物学研究所（MBL）



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改訂履歴
Ver1.0 2006 年12 月
Ver1.1 2013 年 2 月