クロスマッチ解析例

FCMを用いたドナー - レシピエントリンパ球クロスマッチ（フローサイトメトリークロスマッチ）解析例

ドナー（臓器提供者）の末梢血から比重遠心法によって分離した単核球（PBMC）浮遊液にレシピエント（患者）の血清を反応させた後、FITC標識抗ヒトIgG (Fcγ) 抗体で蛍光染色してフローサイトメーターで測定します。
ドナー血清中に抗HLA 抗体などの抗リンパ球抗体が存在すると、陽性反応（蛍光強度の右側へのシフト）として検出されます。

このデータ例では、レシピエントの持つ抗体が T細胞特異的（抗T細胞抗体）なのか B細胞特異的（抗B細胞抗体）なのかを判定するため、 CD3 と CD19 に対する各蛍光標識抗体で T細胞（CD3陽性細胞）、B細胞（CD19陽性細胞）を検出、ゲートして解析しています。

Memo

臓器移植においてレシピエントが移植抗原（ドナーの臓器）に対する特異的抗体を持っていると、antibody mediated rejection を発症し、通常の免疫抑制療法では制御が困難です。
このリスク回避のため、術前にレシピエント血清中の抗ドナー抗体の有無を調べることが不可欠です。
この検査は一般には血清学的手法（LCT法）によって行われていますが、フローサイトメトリーを用いた方法（Flow Cytometry Cross Match, FCXM）を導入することにより、補体非依存性抗体の検出が可能になり、従来よりも高感度な抗体検出が可能です。

この試験は Flow-PRA とともに臓器移植を行う施設で普及しつつあります。

フローサイトメトリークロスマッチ測定までの手順

EDTA採血したドナーの末梢血から比重遠心法によって単核球を分離します。
単核球浮遊液の細胞数を 5×106/mL 程度に調整します。
細胞浮遊液 100µL に、規定量の抗 CD3抗体（PC5標識）、抗CD19抗体（PE標識）、レシピエント血清を添加し攪拌します。
4℃ 暗所で 30～45分インキュベーションします。
リン酸緩衝液（PBS）を加えて遠心し、上清を除去します。
2次抗体（FITC標識抗ヒトIgG 抗体）を添加し攪拌します。
4℃ 暗所で 30～45分インキュベーションします。
リン酸緩衝液を加えて遠心し、上清を除去します。（2回実施）
リン酸緩衝液 500µL を加えて細胞を再浮遊させ、FCMで測定します。

臨床データ例 ①　患者：20代女性　ドナー：患者の母親

	リンパ球全体での反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=0.5%）実線青色：レシピエント血清での結果（陽性率=1.08%）
	抗CD3抗体陽性リンパ球（T細胞）にゲートした反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=0.48%）実線紫色：レシピエント血清での結果（陽性率=1.33%）
	抗CD19抗体陽性リンパ球（B細胞）にゲートした反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=5.99%）実線赤色：レシピエント血清での結果（陽性率=24.70%）

臨床データ例 ②　患者：10代女性（移植歴あり）　ドナー：患者の母親（A24キャリア）

	リンパ球全体での反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=6.79%）実線青色：レシピエント血清での結果（陽性率=47.67%）
	抗CD3抗体陽性リンパ球（T細胞）にゲートした反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=0.47%）実線紫色：レシピエント血清での結果（陽性率=59.31%）
	抗CD19抗体陽性リンパ球（B細胞）にゲートした反応結果点線白抜き：ネガティブコントロール血清での結果（陽性率=12.17%）実線赤色：レシピエント血清での結果（陽性率=51.49%）