細胞外小胞（EV）の世界への招待

細胞外小胞（EV）の世界への招待

細胞外小胞の発見

歴史上、科学と医学分野では、常に、非常に興味深い発見が起きてきました。例えば、細菌が繁殖していたペトリ皿に誤ってアオカビが落ちたことが、抗生物質の偶然の発見につながったという話もそうです。この発見は偶然から学んだ結果と言えます。消化性潰瘍にヘリコバクター・ピロリが関与していることを、自らに菌を投与することで実証したバリー・マーシャルの話も、驚くべきものです。実験を通して学ぶことの力を示したことで、マーシャルは後にノーベル賞を受賞しています。

また、非凡な業績を残したマリ・キュリーについても忘れてはなりません。キュリーはラジウムチューブをポケットに入れ持ち歩いていたと言われ、悲しいことに、 放射能への暴露により白血病を発症してしまいます。これは高い代償と引き換えにもたらされた知識となりました。こうした逸話は、彼らが科学的好奇心に導かれ、 真実を求めて想像を超える旅をしたことを物語るものです。

細胞外小胞（EV）の物語は、血液学、細胞生物学、ウイルス学などのさまざまな分野を横断する「科学的好奇心に導かれた旅の物語」と言えます。このような多様な分野が、この微小で生物学的に活性な小胞の存在を明らかにするために力を合わせるようになりました。それぞれの分野で得られた知見は、私たちの生理機能を制御するEVの重要性を明らかにする上で重要な役割を果たしました。

EVは比較的最近の発見であるにもかかわらず、バイオディスカバリー分野で大きな関心を集めています。現在、多くの科学者が、EVの多様性、生理的機能における役割、さまざまな疾患へ関与している可能性を明らかにする研究に注力しています。

EVs

1930年代、生化学者であるChargaff は、血液から凝固因子を分離するための遠心分離プロトコルの開発に取り組んでいました。その過程で、血漿上清に高速遠心で得た沈殿物を加えることで凝固時間が有意に短縮されることを発見しました（1）。この観察から、血液中に存在する生体分子であるEVの存在が明らかになりました。Westの協力を得て（2）、Chargaff はさらに、31,000 xgの遠心力で沈降し、高い凝固能と血栓形成特性を示す「粒子画分」を同定しました。この画分にはEVが含まれていました。当初、この分離画分に含まれるのは血球の微小な分解産物であると仮定されていました。しかし、さらに20年近くの研究を経てようやく、高速遠心分離により、血小板由来ではあるものの無傷の血小板とは異なる微粒子を同定・区別することに成功しました。ここで同定された粒子は、EVの特性に極めて近いものです（3）。この「血小板ダスト」の最初の電子顕微鏡画像は、EVの外観に関する視覚的情報をもたらしました（Figure 1 ）。

細胞外小胞の概要

  • 細胞外小胞（EV）は、通常約5 nmの厚さのリン脂質膜に覆われています。
  • EVのサイズは様々で、ほとんどの体液に多様なサイズのEVが含まれています。
  • EVの最小サイズはその組成によって異なり、ヒト血漿中で30~50nmです。
  • 一般的にEVのサイズ分布のピークは200 nm未満です。
  • ヒトの血液中では、500 nm未満の球状のEVが全ポピュレーションの約95%を占めています。

 EVs at a glance Figure 1. ‌透過型電子顕微鏡（TEM）による尿中EV（uEV）の特性評価。‌超遠心分離法で分離したuEVのTEM特性評価の代表顕微鏡像。Bertolone et al. Front. Endocrinol. 2023 14:1096441. Published under a Creative Commons Attribution 4.0 International License: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 

 

その後のクロフォードの研究は、EVの膜内に脂質とタンパク質が存在することを明らかにする上で重要な役割を果たし、EVの機能特性の解明に貢献しました（4）。コウモリの冬眠に関する興味深い研究で、当初観察対象としていたのは、多胞体が細胞膜と融合することでEVが細胞から形成され、放出される過程でした（5）。この発見により、EVは哺乳類細胞に限らず、様々な種類の細胞によって作られることが明らかになりました（6）。1980年代は、複雑な膜輸送およびEVの構造・機能の解明、特にタンパク質の取り込み・排出のしくみを中心に研究が行われました（7）。

当初はエクソソーム（スモールマイクロベシクル）と呼ばれていましたが、2011年、脂質二重層に囲まれた複製を行わない粒子を指すものとして「細胞外小胞」という用語が正式に採用されました。同年、ISEVが発足し、EV研究の分析と報告を標準化するためのガイドライン(MISEV)が策定されました（8）。それ以来、カーゴ輸送、バイオマーカー、がん、心血管疾患、感染症、ドラッグデリバリーなどの研究に関する新な知見が数多く生まれています。これらの研究領域は、さまざまな分野でいかにEVが重要であるかを浮き彫りにしています。

科学と医療における細胞外小胞の重要性

細胞外小胞（EV）の発見により、身体はいかに機能するか、がん細胞はどのように転移するのか、病原体はどのように拡散するのかといった、これまでわかっていなかったことが明らかになりました。ですが、EVの秘密を完全に解き明かすためには、まだ多くの調査が必要です。現在、EVは生理的プロセスだけでなく病態においても中心的な役割を果たしていると認識されています。この認識から、過去10年間に研究数は急激に増加し、2022年だけで公表された論文は何千報にものぼります（Figure 2）。


Figure 2: 細胞外小胞（EV）に関連する論文数。この数は、キーワード「細胞外小胞」を使用して取得された、1950年から現在までに論文数。（出典：Pubmed.com) CytoFLEX Platform Analyzers 

EVは、様々な生物のあらゆる種類の細胞で生産されます。EVの発生は、‌(i) 細胞膜から出芽し、より大きな小胞とアポトーシス小体が生じるもの、(ii) エンドソームから出芽した小胞が放出されるものの2タイプに分類できます。‌EVはサイズが小さく（30〜500 nm）、内腔領域を有します。その大きさとタンパク質や核酸を運ぶことができる能力から、科学者たちはEVの機能を理解し、バイオマーカーとしての可能性を探ることに注力しています。

EVは血管新生、細胞移動、細胞間情報伝達などの様々な生理的プロセスに関与していることが研究によって明らかになっています。‌存在数が非常に多いことや、標的細胞に容易に侵入できることから、EVは、末梢循環系および組織の両方で、多くの生理学的プロセスに関与していることが示唆されます（Figure 3）。実際、EVは血液脳関門を通過できるため、神経変性疾患に何らかの役割を果たしていると考えられます(10)。‌さらに、EVは（その他の多くのアプリケーションの1つとして）アルツハイマー病などの疾患の末梢スクリーニングツールのバイオマーカーとして使用できる可能性があります (11)。

EVを治療用途へ応用できる可能性に、ますます大きな関心が集まっています。治療化合物の標的細胞への送達にEVをデリバリーツールとして使用した臨床試験が行われています。特定のマーカーを発現するようにEVを設計することで、体内の特定の部位をターゲットにして細胞内にカーゴを運ぶことができます。この標的化デリバリーは、従来のドラッグデリバリー法よりも特異性が高いという利点があります。EVのマーカーとしてよく用いられるテトラスパニンなどの膜貫通型タンパク質(CD9、CD63、CD81)もこのプロセスに関与します(12)。細胞内に入ると、カーゴは細胞内の成分と相互作用し、シグナル伝達経路に影響を与え、最終的には細胞機能の活性化や抑制、あるいは調節といった目的の結果をもたらします。

EVが細胞の機能を内部から常時調節するこの生理学的プロセスは、特に組織内において、標的細胞と微小環境間の相互作用に影響を与えます。‌一部のがん細胞は、EVを放出することで、他の組織に転移します。EVには、がん細胞の拡散を促進するよう組織微小環境を調整する能力があるためです(13)。‌この作用を抑制する方法を見つけることで、体内のがん細胞の拡がりを抑えることができる可能性があるため、この分野もまた、非常に活発な研究が行われています(14)。

 

How EVs Are Generated:

  • EVがエンドソームより出芽し、多胞体（MVB, multivesicular body）が形成されます。
  • これらのEVは、表面に細胞由来のタンパク質を発現しています。
  • その後、MVBは細胞膜に輸送され、融合します。
  • MVBが融合することで、細胞から細胞外へとEVが放出されます。
  • EVは、表面に存在するタンパク質に対応するレセプターを発現するターゲット細胞に結合します。
  • 標的細胞内に取り込まれると、カーゴを放出します。

Biogenesis of vesicles

Figure 3: 細胞からの小胞の発生と標的細胞への結合。EVとそのカーゴは、多胞体（MVB）に封入されていて、MVBが細胞膜に融合して、EVが細胞外に放出される。

細胞外小胞発見の創世記における遠心分離法

細胞外小胞（EV）の研究とEV分野の発展は、Chargaff’によってEVが最初に発見されて以来、遠心分離プロトコルに大きく依存してきました。‌研究者は、EVの濃縮、分離、特性評価のためのプロトコルを、長年にわたり改良してきました。‌理想的な分離プロトコルは、所要時間とコストを最小限に抑えながら、収率、不均一性、および効率の高いものです。‌EV研究分野が現在のような発展を遂げたのは、研究室でよく確立された技術であり、求める結果を導ける最良の技術である遠心分離法によるものです。‌EVを単離（または回収）する手法には様々なものがありますが、どのような下流アプリケーションに使用するかによって、それぞれの手法の長所と短所を考慮し、適切なプロトコルを決定します(15)。‌EV分離の出発物質には、血漿、血清、尿、脳脊髄液、母乳などの体液を使用するのが一般的です。

EVの単離（または回収）に広く用いられるのは、分画遠心法を含む超遠心分離法です。‌複数の手法を組み合わせて使用することもできますが、遠心分離はほとんどの場合、分離プロトコルに含まれています（Figure 4）。密度勾配遠心法、ろ過、およびサイズ排除クロマトグラフィーに研究者の関心が集まっていますが、その後の精製手法には、依然として超遠心法、密度勾配遠心分離法、またはクロマトグラフィー技術が含まれます。磁気ビーズ分離法は、ターゲットを絞ったアプローチですが、EVの真の不均一性を反映しない可能性があります。‌EVの単離には、コンタミネーション物質の除去と、体液や細胞培養培地に存在するカイロミクロンや脂質などの他の粒子からEVを分離する必要があります（Figure 4）。超遠心分離法は遠心力を利用し、サイズや密度の違いによって成分を分離します。分画超遠心法では、段階的に遠心力を上げて遠心を複数回行い、コンタミネーション物質を取り除き、最終的にEVを沈殿物として回収します。密度勾配超遠心法は、スクロースやイオジキサノールなどで作製した密度勾配を使用して、物理的特性（サイズ、形状、質量、密度）の違いにより粒子を分離する高分解能精製法です 。密度クッション超遠心法はスループットと純度のバランスがよい手法であり、 密度勾配超遠心法は最も純度の高い分離が可能で、分画超遠心法は最も高スループットの分離が可能です。密度勾配超遠心法および分画超遠心分離では、サイズ排除クロマトグラフィーや沈殿法などの他の方法と比較して、最も純度が高く、EVの構造的完全性を維持したサンプルを得ることができます。どの分離方法を採用するかを決定する際、製造やEV治療への応用を考えた場合は特に、スケーラビリティが重要になります(16-19)。

EV isolation

Figure 4: EVの分離には、コンタミネーション物質の除去と、体液や細胞培養培地に存在するカイロミクロンおよび脂質などの他の粒子からEVを分離する必要があります。超遠心分離法は遠心力を利用し、サイズや密度の違いによって成分を分離します。分画超遠心法では、段階的に遠心力を上げて遠心を複数回行い、コンタミネーション物質を取り除き、最終的にEVを沈殿物として回収します。密度勾配超遠心法は、スクロースやイオジキサノールなどで作製した密度勾配を使用して、物理的特性（サイズ、形状、質量、密度）の違いにより粒子を分離する高分解能精製法です。

 

細胞外小胞研究をさらに前へ

細胞外小胞（EV）が初めて発見されてから、数十年が経過しました。EVの生成、制御機能、治療を目的とした機能改変についてより深く理解することで様々なアプリケーションへの応用が期待できることから、近年、EVに大きな期待が集まっています。EVは、あらゆる生細胞が産生し、多くのプロセスを制御できることから、その応用の可能性は無限です。これは同時に、EVについて、まだわかっていない点を解明するためには、さらに研究が必要であることをも意味しています。科学コミュニティは、EVの単離、特性評価、および使用の標準化を強く望んでいます。標準化することで、再現性が向上し、発見を臨床使用に変換することが容易になるためです。

EVにはまだ、明らかにしなければならない重要な特性があります。理解が必要な重要な側面として、まずEVの不均一性があります。EVは単一の実体ではなく、同じ細胞内に存在するものでも組成や大きさが異なることがあります。EVの生成と組成は、細胞の状態や受け取ったシグナルの影響を受けて、継続的に制御されている可能性が高いです（Figure 5）。フローサイトメトリーなどの技術を用いてEVを個別に特性評価することで、EVの不均一性をより深く理解することができます。次に、患者へのドラッグデリバリーに使用するEVをin vitroで生成するスケーラブルな方法を開発することが重要です。この点に関しては、標準ワークフローの定義が不可欠であり、製造プロセスにおいて遠心分離法が重要な役割を担います。最後に、現在行っているの治療薬を開発を促進するためには、さまざまな種類のEVに関連するマッピングマーカー（由来細胞、健康細胞とがん細胞、活性化状態、疾患バイオマーカーなど）が必要です。

EV size and heterogeneity

Figure 5: EVのサイズと不均一性。比較対象として、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、超低密度リポタンパク質（vLDL）と、抗体、ウイルス、バクテリアの平均サイズも示す。

本製品は研究用です。診断には使用できません。

 

フローサイトメトリーによる細胞外小胞の解析
testing

細胞外小胞とは

エクソソームの分離に関するインタビュー
細胞外小胞のカウント・サイズ計測・特性評価に関する包括的ガイド

細胞外小胞の包括ガイド

参考文献

  1. Chargaff, E. J. (1945). Cell structure and the problem of blood coagulation. 160(1), 351–359.
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