分析用超遠心機：汎用性の高い、優れた高分子特性評価手法

分析用超遠心機（AUC） の歴史は20世紀初めまで遡ることができます。AUCは、分散系、特にコロイド溶液に関する研究で1926年にノーベル化学賞を受賞したスウェーデンの化学者テオドール・スヴェドベリによって開発されました。スヴェドベリが最初に開発した分析用超遠心機は、分子量の測定と高分子の沈降挙動の研究を促進しました1。それ以来、AUCは 分子生物学、生化学、薬理学、材料科学、合成高分子化学、その他の様々な分野で不可欠なツールとなっています。

最初に市販されたAUCは1947年にスピンコ社が発売した超遠心機モデルEです。（スピンコ社は1955年にBeckman Instrumentsの遠心機部門として統合）。モデルEは主に分子生物学と生化学においてタンパク質分子量を決定するために用いられました2。しかし、数年後には、機器の保守の複雑さ、データ解析の課題、より定量的な結果が求められるようになったことから、AUCは人気にかげりが見え始めました。

1970年代から1980年代にかけてのデジタルデータ取得やロータデザインにおける技術的イノベーションにより、ベックマン・コールターは1991年に紫外可視吸光測定計を備えた分析用超遠心機XL-Aを、1996年には紫外可視吸光測定計とレイリー干渉検出器を備えた分析用超遠心機Optima XL-Iを発売しました（後にそれぞれ、分析用超遠心機ProteomLab XL-A、分析用超遠心機XL-Iに改名）。こうしたイノベーションによってAUC実験の精度と効率が高まり、応用範囲が拡大しました。

その後2016年に、ベックマンは超遠心機の機能を強化し、より使いやすいよう改良した分析用超遠心機Optima AUCを発売しました。改良点には、個々の波長で複雑なシステムを正確に解析できる多波長測定機能、4～40°Cの範囲で温度を制御できる機能、事実上どこからでもデータのセットアップ、モニタリング、抽出が可能なリモート監視機能、シグナルノイズ比の改善、スキャン速度の向上などが含まれます。

その歴史を通じて、AUCは溶液中の高分子の基本的な性質を理解するのに有用な、汎用性の高い技術であることが証明されてきました。これまでにAUCの使用に関するレビュー論文が複数発表されており、その優れた性能や特長が詳しく述べられています3–7。ここでは、膜タンパク質、抗体、タンパク質-核酸相互作用、ウイルスベクターなど、タンパク質研究の一部を成す様々な領域の探求にOptima AUCを活用した最近の論文をいくつか紹介します。

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Figure 1. AUCの歴史：スヴェドベルクによって初めて開発されたAUC（a）。これ以降、(b) Model E、(c) ProteomeLab XL-I、(d) Optima AUCなどのAUCが市場に登場。

* 周囲温度が25°C未満の条件下。

AUCは、開発されて以降、タンパク質やタンパク質治療薬の特性評価に欠かせない技術となっています8。凝集体が存在すると、薬効が低下し、免疫反応を惹起する可能性があるため、抗体などのタンパク質治療薬を開発する際には凝集体の形成を最小限に抑えることが重要です9 。したがって、溶液中に存在する可能性のあるオリゴマーと凝集体を注意深く特性評価することが不可欠です。一般的に、開発や品質管理における凝集体の定量にはサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）が用いられますが、SECには、サンプルが希釈される、凝集体が解離してしまう可能性、バッファー液に制限がある、カラムマトリックスと相互作用するなどの問題があることから、より正確な特性評価を行うにはAUCのような直交技術を使用する必要があります9–12。沈降速度AUC（SV-AUC）は固定相の影響を排除しながら流体力学的特性に基づいて分子や粒子を区別できるため、生物学的凝集体やオリゴマーの定量に特に有用です。

Optima AUCでは、紫外可視吸光測定計およびレイリー干渉検出器による2種類の検出方法が使用可能で、単独、もしくは2つ同時に使用して、粒子が沈降する過程で形成される半径方向の濃度分布を測定できます。紫外可視吸光測定計を使用する場合、一般的に、測定する波長での光学密度（OD）が0.3～1の範囲内に保たれる濃度が推奨されます。最も一般的に使用されるセンターピースは沈降経路長が12 mmですが、より高い濃度を測定する場合は沈降経路長が3 mmのセンターピースを使用します。さらに、低濃度のタンパク質溶液の測定が必要な場合には、215～230nmの範囲の波長を使用するのが一般的です。しかし、この範囲では波長間のODの変化が大きいため、測定する波長が変わることで結果の一貫性が損なわれてしまう可能性があります。これは特に、波長精度が4nmに指定されている旧式のProteomeLab AUCで特に顕著です14,15。Optima AUCが搭載する紫外可視吸光測定計はこれより優れており、波長精度は0.5nmに指定されています。そのため設定波長と実際の波長が確実に一致し、正確で信頼性の高い結果が得られます。これよりはるかに高い濃度が必要な場合や、測定する粒子に吸光性がない場合には、レイリー干渉検出器を使用します。レイリー干渉検出器では、参照溶液と比較することで溶液の屈折率の変化を測定し、最高濃度45 mg/mLまでモノクローナル抗体の測定が可能です13。

超遠心沈降速度法（SV-AUC）には、スループットの低下など、タンパク質治療薬の特性評価に用いる場合に制約となるものがいくつかあるものの、モノクローナル抗体（mAb）製剤の凝集体の特性評価に推奨される方法であることに変わりはありません9。また、Optima AUCでは、紫外可視吸光測定計を強度モードで測定する際に、AUCセルの両方のチャネルでサンプルを測定できるようにすればスループットを向上させることが可能です。Bou-Assaf, G., et al.により、起こり得る問題への対処法、タンパク質治療薬製剤（主にmAb）中の凝集体の設計、処理、および解析に役立つ包括的ガイドが作成されています9。

様々な細胞プロセスや制御に関与する膜タンパク質も、非常に研究が盛んな分野です。しかし、膜タンパク質の精製は困難で、洗剤中での膜タンパク質の安定性がボトルネックとなっています16。Li, D., et al.は、異なる洗剤中における膜タンパク質TmrAの挙動をSV-AUCで定量的に評価し、膜タンパク質の精製を最適化するための洞察を示しました16。Li, D.らは、紫外可視吸光測定計とレイリー干渉検出器を組み合わせて使用することで、タンパク質の立体配座状態と凝集状態を様々な濃度における沈降係数を基に評価し、洗剤を高い濃度で添加する工程を最適化しました（Figure 2）。

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Figure 2. 様々な濃度で精製またはDDMを添加した場合の膜タンパク質TmrAの沈降係数。AとBは、紫外可視吸光測定計で測定したTrmAの測定結果を２つの異なる濃度で比較したもの。CとDはレイリー干渉検出器で測定した結果の比較。詳細については、Li et al. 2021 DOI：10.3390/membranes11100780, https://creativecommons.org/licenses/ by /4.0/を参照。画像は無修正。

タンパク質の核酸相互作用も、AUCの高い特性評価能力の恩恵を受ける研究分野であり、Optima AUCに多波長測定機能が追加されて以降は特にその恩恵は大きくなっています。多波長超遠心分析（MW-AUC）はタンパク質-核酸相互作用の化学量論と熱力学を理解する上で極めて重要です。MW-AUCは溶液中の分析物を流体力学とスペクトル特性に基づいて分解してモル量と化学量論を決定するため、その相互作用をより包括的に評価することができます17。Horne, C., R., et al.は、MW-AUC を用いて、細菌の転写調節因子が環境変化に応じて遺伝子の発現を調節する機能を明らかにしました18。そのためには、タンパク質-DNA結合に関与する化学量論を検証することによって、このような相互作用を熱力学的な視点から解明する必要がありました。遠心力によって相互作用している分子と相互作用していない分子を流体力学的に分離し、タンパク質とDNAからスペクトル信号を光学的に分離することにより、それぞれの沈降係数における分子のモル濃度を決定しました。その結果、NanRタンパク質の3つのダイマーがDNAのリピートオペレータに低ナノモル親和性で連続的に結合することが明らかになりました（Figure 3）。この実験は、その他のいくつかの実験17,19–21 とともに、MW-AUCを用いることによってより多くの知識が得られることを示すとともに、多波長AUCが複雑な生物学的相互作用の理解を促進する上で、非常に重要な役割を果たすことを浮き彫りにしています。

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Figure 3. MW-AUCを用いて、NanRとDNAの相互作用を光学的にデコンボリューションした研究。コントロールNanR（青）とDNA（黒）の沈降係数分布をそれぞれ280nmと260nmで測定。(b-e) DNAへのNanR濃度を増加させながら行ったタイトレーションによって得られた沈降係数に、複合体の形成と一致したシフトが生じた。薄いグレーの領域はヘテロ錯体で、それぞれのモル比も共に示した。詳細については、Horne et al. 2021 DOI：10.1038/s41467-021-22253-6, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/を参照。画像は無修正。

近年では、AUCは薬物送達に用いられるウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（AAV）の特性評価に広く適用されるようになりました22。AAV治療法の安全性と有効性は、中空／中間体キャプシドやその他の汚染物質（エンドトキシン、残留宿主細胞DNA、欠陥粒子など）による品質問題によって損なわれ、これが大規模生産と患者の安全性に影響を与えてしまう可能性があります23。AUCは、溶液中の粒子の大きさ、密度、形状を検出し、それに基づいて分画することができるため、AAVの属性（沈降係数、完全体、中空、中間体のキャプシドの割合、汚染物質の存在など）に関して特性評価ができます（Figure 4）24,25。

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Figure 4. AAVを充填度で区別することができるAUCの性能を示す実験データ。(a) 充填度の異なるキャプシド（ncapsid）および完全長ssDNA（nssDNA）の組み合わせの図解（左）と、理論的な相関性を示す沈降係数（右）。右側は、キャプシドあたりのヌクレオチド数と粒子のそれぞれの結合状態を示すS値の相関プロット。(b)各成分のモル吸光係数スペクトルを用いた多重回帰分析によって計算が可能な、AAVキャプシド中のヌクレオチドの数。詳しくは、文献を参照。(c) AAV1サンプルの沈降速度超遠心の結果。中空、中間体、完全体のキャプシドと、キャプシドの凝集体を表示。キャプシド凝集体の図は、構成要素の一例として提示したもの。詳しくはMaruno et al. 2021.doi 10.1016/J.xphs.2021.06.031, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/を参照。画像は無修正。

考察

分析用超遠心機は、溶液中の高分子の基本的性質を理解するために用いられる、汎用性の高い優れた技術です。AUC技術が進歩を続けていることは、AUCが様々な研究分野で欠くことのできない重要な役割を果たしていることを示しています。最新のAUCであるOptima AUCでは、波長精度の向上などの改良が行われ、測定の信頼性が向上しました。これは、波長間のODの変化が急な215～230 nmの範囲の低濃度タンパク質を測定する場合に特に有用です。高速スキャン機能によって、高密度の生データセットを取得できるようになり、RSMDの改善や、沈降速度の速い分析物に関する情報収集に役立ちます。多波長機能によって、タンパク質とDNAの重なり合うシグナルをスペクトルの違いに基づいて別々のプロファイルにデコンボリューションすることが可能になった結果、相互作用錯体のモル化学量論を直接評価できるようになり、ウイルスベクターの充填状態の評価が改善されています。スループットは紫外可視吸光測定計で測定することによっても向上させることができますが、これは、強モードで測定する場合は検体を両方のチャネルで測定できるためです*。本稿ではOptima AUCの優位性を示す一部の出版物を中心に取り扱いました。AUCは、タンパク質精製の最適化から複雑な相互作用の特性評価、遺伝子治療薬および薬物送達ベクターの品質保証に至るまで、科学的前進の駆動力となる重要な洞察を提供し続けています。本稿は、近年の研究のレビューを通じて、AUCが現代科学研究においてこれからも変わらぬ優位性を持つものであり、また、その機能・性能はさらに進化するものであることを強調します。

*高濃度サンプルは、サンプルチャネル（チャネルA）にセットします。

参考文献

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