EMnetik 24 システム サポート

EMnetik PCR Cleanup:リミット

  • EMnetik PCR Cleanupは、20~50 µLのサンプル液量および溶出液量に対応しており、この範囲外では収率低下の可能性があります。溶出液量 50 µLを推奨していますが、EMnetik 24では最少 20 µLまで対応しています。溶出液量が少ないと収率や純度が低下する場合があります。
  • 濃度は800ng/µLまで、DNAサイズは10kbまでに対応します。
  • DNAサイズの制限により、現在ゲノムDNAの精製には対応していません。

EMnetik PCR Cleanup:よくある質問

Q:磁性ビーズをサンプルに加える前に、磁性ビーズを何回ピペットで混合すればよいですか?
A:最初に試薬ボトルを30秒間ボルテックスする必要があります。リザーバーに分注した磁性ビーズを、分注前にピペットで10回以上または完全に懸濁するまで混合します。

Q:推奨されていないチューブ・プレートを使用してもいいですか?
A:EMnetik PCR Cleanupは、推奨のチューブ・プレートで最適化されています。サンプル混合と磁性ビーズ分離には、チューブ・プレートが本体チューブホルダーの底に完全に接触することが重要です。

Q:他の磁性ビーズを使用できますか?
A:使用できません。他の磁性ビーズはうまく混ざらず、著しく収量が低下します。

Q:EMnetik PCR Cleanupは、AMPureXPやSPRISelectのようにDNAサイズセレクションができますか?
A:この磁性ビーズは、DNAサイズセレクション用途には推奨されません。

Q:サンプル量あたりのEMnetik PCR Cleanup試薬量を減らすことはできますか?
A:できません。適切な混合のためには、EMnetik PCR Cleanup試薬はサンプル量に対して1.8倍の比率で添加する必要があります。

Q:「Bind mix & separate」ステップをさらに時間をかけて行うことはできますか?
A:磁性ビーズへの結合時間を最適化したい場合は、ユーザーインターフェースの「Bind mix & separate」ステップをハイライトしてクリックすることで、「Bind mix & separate」ステップを再実行することができます。これは、DNA濃度が非常に高いまたは低い場合に有効です。
NOTE:「Bind mix & separate」ステップを何度も実行する場合は、その間に「Initialize & add reagent」ステップを実行してマグネットをリセットしてください。

Q:TEバッファーで溶出できますか?
A:可能です。ただし、水で溶出した方が若干収量が高くなるケースも見られます。

Q:指定された時間より長く溶出してもいいですか?
A:溶出時間を最適化したい場合は、ユーザーインターフェースの「Elution mix & separate」アイコンを押して、溶出・混合ステップを再実行することができます。これは、磁性ビーズを乾燥させすぎた場合に有効です。
NOTE:「Elution mix & separate」ステップを何度も実行する場合は、その間に「Initialize and add reagent」ステップを実行してマグネットをリセットしてください。

EMnetik PCR Cleanup:トラブルシューティング

低収量:

考えられる原因 解決案と追加情報
EMnetik PCR Cleanup 試薬の懸濁が不十分
試薬ボトル中の磁性ビーズが懸濁されているように見えても、使用する直前に30秒間再懸濁してください。リザーバーを使用する場合、混合した磁性ビーズ試薬をリザーバーに移したら、すぐに分注してください。
磁性ビーズを失っている ピペッティングでの磁性ビーズ損失:上清を除去するとき、チップに磁性ビーズが触れないようにしてください。磁性ビーズをチップで吸ってしまった場合は、マグネットの部分に磁性ビーズを戻してから再度ピペッティングしてください。マグネットへの分離不十分による磁性ビーズ損失:ピペッティングで上清を除去する前に、磁性ビーズがチューブ・ウェルの側面に集まっていることの目視確認に加え、プロトコルステップがDoneになるまで待ってください。
エタノール濃度が低い

エタノールには吸湿性があり、時間とともに濃度が下がる場合があります。75%エタノールは用事調製してください。

DNase の混入 DNaseを持ち込まないにようにする。チップの先端を滅菌していない表面に触れないようにする。
磁性ビーズの過剰な乾燥 プロトコルで指定された時間よりも、磁性ビーズを長く乾燥させないでください。
不十分な溶出 溶出液を磁性ビーズに十分に行き渡らせてください。ウェル・チューブの壁面に付着した溶出液がないことを確認してください。
推奨外のチューブ・プレートの使用        推奨されていないチューブ・プレートを使用すると、高さなどが合わずに十分に混合できない場合があります。チューブ・プレートが推奨品であることを確認してください。

低精製度:

考えられる原因
解決案と追加情報
エタノール濃度が高い    純度を上げるためにWashのエタノール濃度を70%に下げることもありますが、その場合は収率が低下する可能性があります。

エタノールの残留:

考えられる原因
解決案と追加情報
エタノールの不十分な除去
20μLまたは(チップ先端が細い)ゲルローディングチップを使ってエタノールを除去します。このとき、壁面から液滴を取り除くようにします。液滴を底部に移動させて除去しやすくするために必要に応じて装置からチューブ・プレートを外して軽く叩き、ウェルの底からピペッティングします。「Ethanol Dry & Add eluent」ステップの前に、目に見えるエタノールを完全に除去してください。乾燥時間が十分で、溶出前にチューブ内に目に見える液滴がないことを確認してください。
エタノールが磁性ビーズにまとわりついている チューブ・プレートを装置から取り出し、磁性ビーズを落ち着かせた後(30秒)、マグネットに戻して余分なエタノールを除去します。マグネットに戻す前に、壁面に付着した磁性ビーズを取り除くために短時間遠心分離することもできます。磁石に引き寄せられない磁性ビーズもありますが、エタノールの液滴を十分に除去すれば、溶出液を加えたときにこれらの磁性ビーズは回収することができます。乾燥時間を長くすることも、解決策になります。
エタノールが残っているかどうか判断できない      

チューブ・プレートを装置から取り出して調べて下さい。チューブ・プレートを装置に戻し、磁性ビーズを再度マグネットで分離してから(10秒)、エタノールを除去して下さい。

EMnetik Plasmid Purification:よくある質問

Q:プロトコルと異なるサンプル量から抽出できますか?
A:プロトコルはEMnetik 24に最適化されており、サンプル・イソプロパノール・磁性ビーズの濃度比に影響が出たり、混合が不完全になることで収量が減少します。

Q:溶出量を50µL以下にすることはできますか?
A:50µLの溶出量を推奨していますが、EMnetik 24は20µLの溶出量にも対応しています。しかし、溶出量が少ないと収量や純度が下がる可能性があります。

Q:磁性ビーズとイソプロパノールを前もって混ぜておいてもいいですか?
A:磁性ビーズとイソプロパノールは、EMnetik 24で処理する30分前に混合することができますが、混合して15分経過すると収量が低下する可能性があります。

Q:磁性ビーズは分注のたびに再懸濁する必要がありますか?
A:はい、毎回磁性ビーズを懸濁する必要があります。磁性ビーズはすぐに沈降するため、十分に懸濁しないと磁性ビーズの量が不正確になり、抽出性能が低下することがわかっています。

Q::30秒間ボルテックスする必要がありますか?
A:はい、最適な抽出パフォーマンスのために必要です。PLPボトルを30秒間ではなく10秒間に短縮してボルテックスすると、抽出性能が低下することがわかっています。

Q:他の磁性ビーズは使用できますか?
A:いいえ、サポートされていない他の磁性ビーズではうまく混合できず、大幅な収量低下を招きます。

Q:サンプル量あたりの磁性ビーズの添加量を減らすことはできますか?
A:できません。バッファー・イソプロパノール・磁性ビーズは正確な比率である必要があります。

Q:「Bind Mix & Separate」ステップをさらに時間をかけて行うことはできますか?
A:磁性ビーズへのDNA結合時間を延長したい場合には、ユーザーインターフェースの「Bind Mix & Separate」アイコンを押して、「Bind Mix & Separate」ステップを再実行することができます。これは、極端に高濃度・低濃度のDNAや大きなプラスミドがある場合に有効です。「Bind mix & separate」ステップを何度も実行する場合は、その間に「Initialize & add reagent」ステップを実行してマグネットをリセットしてください。

Q:菌体由来の凝集の一部をチューブ・プレートに移してしまいました。どうしたらいいですか?
A:菌体凝集が結合ステップに持ち込まれてしまうと、品質の低下やゲノムDNAの混入が起きる可能性があります。菌体凝集を持ち込みそうな場合には、遠心分離の時間を延長してください。

Q:凍結した大腸菌沈殿をプラスミド抽出に使用できますか?
A:-20℃で凍結した大腸菌沈殿を使用することができます。凍結された菌体沈殿を十分に再懸濁する必要があります。

Q:大腸菌のライセートを調製する際に、プレートではなくシングルチューブを使うことはできますか?
A:はい。マイクロチューブを使用する場合、時間短縮およびパフォーマンス最適化のために以下のプロトコル変更を行うことができます。中和:シェーカーで10分間攪拌する代わりに、転倒混和5~10回を行います。遠心分離:時間を10分に短縮し、速度を10,000 rcf以上に上げます。 

EMnetik Plasmid Purification:トラブルシューティング

低収量:

考えられる原因
解決案と追加情報
PLPボトルの磁性ビーズ懸濁が不十分 PLPボトル中の磁性ビーズが懸濁されているように見えても、使用する直前に30秒間再懸濁してください。
イソプロパノール/磁性ビーズ濃度が不適切
ウェルに分注する前に磁性ビーズが完全に懸濁されていることを確認してください。磁性ビーズとイソプロパノールの容量が正しく計算されていることと、磁性ビーズがチップの外側に付着していないことを確認してください。
大腸菌の細胞数が足りない

大腸菌のペレットが小さく見える場合や、測定した細胞数が少ない場合は、適切な培養ができるように増殖パラメータを調整してください。菌体のペレット化は、必ず対数増殖期に行ってください。抗生物質の添加量が多すぎたり少なすぎたりしないようにしてください。適切な培地で細胞を培養してください。培養中に十分な撹拌を行い、十分な酸素を供給してください。
植菌量を最適化してください。前培養が過剰増殖でないことを確認してください。遠心分離の際にすべての大腸菌がペレット化されているか、またデカンテーションのときにペレットが剥がれ落ちていないかを確認してください。ペレット化した大腸菌が死滅期にある場合はプラスミドを失っている可能性があり、収量の低下につながります。細胞が死滅期に入っていないことを、必ず成長曲線で判断してからペレット化してください。

磁性ビーズの乾燥
大きなプラスミドは磁性ビーズに強固に結合します。プラスミドを抽出する際は、磁性ビーズを完全に乾燥させないようにしてください。
磁性ビーズの混合不足 すべての分注ステップで、磁性ビーズがよく混ざっていることを確認してください。
磁性ビーズの損失 マグネットにより磁性ビーズの挙動が安定してから上清を除去し、磁性ビーズを損失しないようにしてください。
チューブ・プレートの形状がEMnetik 24に合わない
チューブ・プレートが本体プレートホルダーに完全に収まっていることを確認してから進めてください。シングルチューブを使用する場合は、チューブを固定するアタッチメントが挿入されていることを確認してください。チューブ・プレートが正しくセットされていないと、結合時や溶出時に混合が不十分になる可能性があります。
エタノール濃度 70%エタノールは用事調製してください。エタノールには吸湿性があるため、時間経過とともに濃度が低下します。エタノール濃度が低いと収量が低下します。
菌体ペレットの不十分な再懸濁         
ピペッティングで菌体ペレットを再懸濁できない場合は、ボルテックスまたはオービタル/プラットフォームシェーカーで30秒間混合してください。

RNAの溶出:

考えられる原因
解決案と追加情報
PLPボトルの磁性ビーズ懸濁が不十分
PLPボトル中の磁性ビーズが懸濁されているように見えても、使用する直前に30秒間再懸濁してください。
イソプロパノール/磁性ビーズ濃度が不適切
ウェルに分注する前に磁性ビーズが完全に懸濁されていることを確認してください。磁性ビーズとイソプロパノールの容量が正しく計算されていることと、磁性ビーズがチップの外側に付着していないことを確認してください。
大腸菌の細胞数が足りない
大腸菌のペレットが小さく見える場合や、測定した細胞数が少ない場合は、適切な培養ができるように増殖パラメータを調整してください。菌体のペレット化は、必ず対数増殖期に行ってください。抗生物質の添加量が多すぎたり少なすぎたりしないようにしてください。適切な培地で細胞を培養してください。培養中に十分な撹拌を行い、十分な酸素を供給してください。
植菌量を最適化してください。前培養が過剰増殖でないことを確認してください。遠心分離の際にすべての大腸菌がペレット化されているか、またデカンテーションのときにペレットが剥がれ落ちていないかを確認してください。ペレット化した大腸菌が死滅期にある場合はプラスミドを失っている可能性があり、収量の低下につながります。細胞が死滅期に入っていないことを、必ず成長曲線で判断してからペレット化してください。
磁性ビーズの乾燥
大きなプラスミドは磁性ビーズに強固に結合します。プラスミドを抽出する際は、磁性ビーズを完全に乾燥させないようにしてください。
磁性ビーズの混合不足
すべての分注ステップで、磁性ビーズがよく混ざっていることを確認してください。
磁性ビーズの損失  マグネットにより磁性ビーズの挙動が安定してから上清を除去し、磁性ビーズを損失しないようにしてください。
チューブ・プレートの形状がEMnetik 24に合わない
チューブ・プレートが本体プレートホルダーに完全に収まっていることを確認してから進めてください。シングルチューブを使用する場合は、チューブを固定するアタッチメントが挿入されていることを確認してください。チューブ・プレートが正しくセットされていないと、結合時や溶出時に混合が不十分になる可能性があります。
エタノール濃度
70%エタノールは用事調製してください。エタノールには吸湿性があるため、時間経過とともに濃度が低下します。エタノール濃度が低いと収量が低下します。
菌体ペレットの不十分な再懸濁         
ピペッティングで菌体ペレットを再懸濁できない場合は、ボルテックスまたはオービタル/プラットフォームシェーカーで30秒間混合してください。

凝集体について:

考えられる原因
解決案と追加情報
PLPボトルの磁性ビーズ懸濁が不十分
PLPボトル中の磁性ビーズが懸濁されているように見えても、使用する直前に30秒間再懸濁してください。
イソプロパノール/磁性ビーズ濃度が不適切
ウェルに分注する前に磁性ビーズが完全に懸濁されていることを確認してください。磁性ビーズとイソプロパノールの容量が正しく計算されていることと、磁性ビーズがチップの外側に付着していないことを確認してください。
大腸菌の細胞数が足りない
大腸菌のペレットが小さく見える場合や、測定した細胞数が少ない場合は、適切な培養ができるように増殖パラメータを調整してください。菌体のペレット化は、必ず対数増殖期に行ってください。抗生物質の添加量が多すぎたり少なすぎたりしないようにしてください。適切な培地で細胞を培養してください。培養中に十分な撹拌を行い、十分な酸素を供給してください。
植菌量を最適化してください。前培養が過剰増殖でないことを確認してください。遠心分離の際にすべての大腸菌がペレット化されているか、またデカンテーションのときにペレットが剥がれ落ちていないかを確認してください。ペレット化した大腸菌が死滅期にある場合はプラスミドを失っている可能性があり、収量の低下につながります。細胞が死滅期に入っていないことを、必ず成長曲線で判断してからペレット化してください。
磁性ビーズの乾燥
大きなプラスミドは磁性ビーズに強固に結合します。プラスミドを抽出する際は、磁性ビーズを完全に乾燥させないようにしてください。
磁性ビーズの混合不足
すべての分注ステップで、磁性ビーズがよく混ざっていることを確認してください。
磁性ビーズの損失
マグネットにより磁性ビーズの挙動が安定してから上清を除去し、磁性ビーズを損失しないようにしてください。
チューブ・プレートの形状がEMnetik 24に合わない
チューブ・プレートが本体プレートホルダーに完全に収まっていることを確認してから進めてください。シングルチューブを使用する場合は、チューブを固定するアタッチメントが挿入されていることを確認してください。チューブ・プレートが正しくセットされていないと、結合時や溶出時に混合が不十分になる可能性があります。
エタノール濃度
70%エタノールは用事調製してください。エタノールには吸湿性があるため、時間経過とともに濃度が低下します。エタノール濃度が低いと収量が低下します。
菌体ペレットの不十分な再懸濁         
ピペッティングで菌体ペレットを再懸濁できない場合は、ボルテックスまたはオービタル/プラットフォームシェーカーで30秒間混合してください。

エタノールの残留:

考えられる原因
解決案と追加情報
エタノールの不十分な除去
20μLまたは(チップ先端が細い)ゲルローディングチップを使ってエタノールを除去します。このとき、壁面から液滴を取り除くようにします。液滴を底部に移動させて除去しやすくするために必要に応じて装置からチューブ・プレートを外して軽く叩き、ウェルの底からピペッティングします。
エタノールが磁性ビーズにまとわりついている
チューブ・プレートを装置から取り出し、磁性ビーズを落ち着かせた後(30秒)、マグネットに戻して余分なエタノールを除去します。マグネットに戻す前に、壁面に付着した磁性ビーズを取り除くために短時間遠心分離することもできます。磁石に引き寄せられない磁性ビーズもありますが、エタノールの液滴を十分に除去すれば、溶出液を加えたときにこれらの磁性ビーズは回収することができます。乾燥時間を長くすることも、解決策になります。
エタノールが残っているかどうか判断できない       
チューブ・プレートを装置から取り出して調べて下さい。チューブ・プレートを装置に戻し、磁性ビーズを再度マグネットで分離してから(10秒)、エタノールを除去して下さい。

 

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