細胞内サイトカインの測定
生体内では細胞の分化、増殖および恒常性を維持するために、細胞同士が様々な情報を交換しています。サイトカインはその細胞間情報伝達物質（液性因子）として、免疫 反応において中心的な役割を担っています。
従来、細胞のサイトカイン産生の観察は、細胞培養上清中に含まれる（細胞外に分泌された）サイトカインの測定が一般的に用いられてきましたが、近年ではフローサイトメーター（FCM）を用いて細胞内のサイトカインを簡単に測定することが可能になりました。FCMでは、分泌される前の"細胞内サイトカイン"を検出することで、個々の細胞のサイトカイン産生を測定することができます。
細胞内サイトカインの測定には、簡便で細胞への影響の少ない細胞膜透過処理試薬 IntraPrep「（製品番号A07802、A07803）」と、弊社の各種細胞内サイトカイン抗体をお勧めいたします。さらに細胞表面に対する抗体を組み合わせることにより、特定の細胞が産生するサイトカインを検出することもできます。
ここでは、細胞刺激によるサイトカイン産生およびFCMを用いた細胞内サイトカイン 測定・解析方法をご紹介いたします。
原理
- PMA およびIonomycin などの存在下で細胞を刺激して活性化させ、細胞内にサイトカインを産生させます。この時メディウム中に細胞内タンパク質輸送をブロックする（ゴルジ体からのタンパク質輸送をブロック）薬剤（Brefeldin A またはMonensin）を添加して、産生サイトカインを細胞内に蓄積させます。
- 細胞膜透過処理試薬IntraPrep（カタログ番号A07802 またはA07803）を用いて細胞を固定し、膜透過処理を行います。
- 細胞内サイトカインに対する抗体を用いて、細胞内サイトカインを染色します。
- FCM で分析します。
準備
Ⅰ. 器具
● ヘパリン採血管（EDTA 採血不可）
● プラスチックシャーレまたはプラスチックチューブ
● FCM 用サンプルチューブ（カタログ番号 2523749、A26428 など）
● FCM
Ⅱ. 試薬
● PMA（Phorbol 12-Myristate 13 Acetate）
（Calbiochem Novabiochem #524400 など）
・ 0.1 mg／mL の濃度になるように、DMSO またはエタノールに溶解します。
（溶解したものは 10～20 μL に小分けにし、－20℃で保存（ストック）します。
この際、凍結・解凍を繰り返さないようにしてください。）
・ 上記のストック 10 μL を990 μL の無菌のPBS またはRPMI1640 メディウムで
100 倍希釈します（1 μg／mL）。………①
・ 活性化メディウムに最終濃度 40 ng／mL で使用します（次ページ参照）。
● Ionomycin（Sigma #I-0634 など）
・ 1 mg／mL の濃度になるように、DMSO またはエタノールに溶解します。
（溶解したものは 10～20 μL に小分けにし、－20℃で保存（ストック）します。
この際、凍結・解凍を繰り返さないようにしてください。）
・ 上記のストック 10 μL を90 μL の無菌のPBS またはRPMI1640 メディウムで
10 倍希釈します（100 μg／mL）。………②
・ 活性化メディウムに最終濃度 4 μg／mL で使用します（次ページ参照）。
● Brefeldin A（Sigma #B7651 など）またはMonensin（Calbiochem Novabiochem #475897 など）
・ Brefeldin A は5 mg／mL の濃度になるように、DMSO またはメタノールに溶解します。
（溶解したものは 10～20 μL に小分けにし、－20℃で保存（ストック）します。
この際、凍結・解凍を繰り返さないようにしてください。）
・ 上記のストック 10 μL を90 μL の無菌のPBS またはRPMI1640 メディウムで
10 倍希釈します（500 μg／mL）。………③
・ 活性化・非活性化メディウムに最終濃度 40 μg／mL で使用します（次ページ参照）。
・ Monensin は2 mM になるように、DMSO またはメタノールに溶解します。
・ 上記のストック 10 μL を90 μL の無菌のPBS またはRPMI1640 メディウムで
10 倍希釈します（200 μM）。………④
・活性化・非活性化メディウム作製時に最終濃度 2 μM で使用します（次ページ参照）。
注：PMA、Ionomycin、Brefeldin A、Monencin は、弊社では取り扱っておりません。
● IntraPrep（カタログ番号 A07802、A07803）
● 細胞内サイトカイン抗体：IFN-γ-FITC（カタログ番号IM2716U）、IFN-γ-PE（IM2717U）、IL-2-PE（IM2718U）、IL-4-PE（IM2719U）など
● 細胞表面抗原に対する抗体：CD3-FITC（A07746）、CD3-PE（A07747）、CD4-PC5（A07752）など
Ⅲ. バッファおよびメディウム
● PBS
● 0.5％ ホルムアルデヒド加 PBS
● 10％ FCS-RPMI1640 メディウム（4℃で保存可能）
RPMI1640 メディウムに以下の最終濃度になるように各試薬を添加します。
・ 10％ FCS（Hyclone #SH30080 など）
・ 2 mM L-Glutamine（RPMI1640 メディウムに予め含まれている場合は不要；Sigma#G7513 など）
● 活性化メディウム（用時調製）
・ 作製した 10％ FCS-RPMI1640 メディウムに、最終濃度 40 ng／mL PMA、4 μg／mL Ionomycin、
40 μg／mL Brefeldin A または2 μM Monensin となるように試薬を添加します。
例：・10％ FCS-RPMI1640 メディウム 1 mL
・PMA（1 μg／mL 前ページ①） 40 μL
・Ionomycin（100 μg／mL 前ページ②） 40 μL
・Brefeldin A（500 μg／mL 前ページ③） 80 μL
またはMonensin（200 μM 前ページ④） 10 μL
● 非活性化（コントロール）メディウム（用時調製）
・ 作製した 10％ FCS-RPMI1640 メディウムに、最終濃度40 μg／mL Brefeldin A または2 μM Monensin と
なるように試薬を添加します。
例：・10％ FCS-RPMI1640 メディウム 1 mL
・Brefeldin A（500 μg／mL 前ページ③） 80 μL
またはMonensin（200 μM 前ページ④） 10 μL
方法
【細胞の活性化】
サイトカインは、細胞が活性化することにより産生されます。細胞を活性化させる試薬；PMA およびIonomycin 存在下で細胞を活性化させ、細胞内にサイトカインを産生させます。さらにサイトカインの細胞外放出を阻害する試薬（Brefeldin A またはMonensin）を作用させることにより、産生されたサイトカインは細胞内に蓄積されます。この細胞内に蓄積されたサイトカインを蛍光標識抗体で染色して細胞内サイトカインを検出します。
細胞の活性化による細胞内サイトカインを正確に同定するためには、ネガティブコントロールとして活性化試薬（PMA、Ionomycin）を除いた非活性化（コントロール）メディウムを用いて、コントロール実験を同時に行うことをお勧めします。
- ヘパリン採血した全血と、上記のように作製した活性化メディウム、または非活性化（コントロール）メディウムを 1：1 の割合で混合します。
- 37℃、CO2 5.0％で４時間インキュベートします。
- 冷PBS を加えて反応を止めた後、4℃、300×ｇ、5 分間遠心して上清を除去します。
注： PMA＋Ionomycin による刺激の際には、Ca2+を必要とします。採血時に使用するEDTA（抗凝固剤）はCa2+をキレートしますので、刺激を阻害する可能性があります。採血にはヘパリン採血管をご使用ください。
注： 通常は 4 時間の刺激でサイトカインは産生されますが、細胞やサイトカインの種類によっては適した時間が異なります。また、ふた付のチューブなどをご使用の場合は、メディウムのpH を適した状態に保つために、ふたをゆるめてCO2 の出入りができるようにしてください。
【細胞の染色】
PMA およびIonomycin による刺激により産生した細胞内サイトカインを蛍光標識抗体で染色します。細胞表面染色と組み合わせる場合は、まず細胞表面から染色します。
- 活性化反応を止めた細胞を、冷PBS で2 回洗浄します（4℃、300×ｇ、5 分間遠心）。
- 上清を除去して細胞をほぐし、PBS（室温）を50 μL／テスト（白血球5×105 個）となるように加えます。
- 調整したサンプルを50 μL ずつ、1 項目につき4 本のサンプルチューブに分注します。
| 活性化サンプル | 非活性化（コントロール）サンプル |
|---|---|
| ① アッセイチューブ | ① アッセイチューブ |
| ② アイソタイプコントロールチューブ | ② アイソタイプコントロールチューブ |
＜参考＞ここで、機器設定（蛍光補正）用チューブ（使用する蛍光色素を単染色したもの）を用意しておくと便利です。
（細胞内サイトカインのみ染色する場合は、4、5、6 は省略）
アイソタイプコントロールチューブには、アイソタイプコントロール抗体〔マウスIgG1-FITC（IM0639）、マウスIgG1-PC5（A07798）、マウスIgG1-PE （A07796）、マウスIgG2a-PE （A09141）など）を加えます。
＜参考＞蛍光補正用チューブには、使用する蛍光標識の細胞表面抗原（発現が強いものの方が便利）に対する抗体〔CD3-FITC（A07746）、CD8-PE（A07757）、CD4-PC5 （A07752）など〕を適量加えます。
アイソタイプコントロールチューブにはアイソタイプコントロール抗体〔〔マウスIgG1-FITC（IM0639）、マウスIgG1-PC5（A07798）、マウスIgG1-PE （A07796）、マウスIgG2a-PE （A09141）など〕を加えます。
＜参考＞蛍光補正用チューブには、何も添加しないでください。
注： IntraPrep 処理をしたサンプルは、室温で保存する場合は2 時間以内、2～8℃（暗所）で保存する場合は 24 時間以内に分析を行ってください。
データ例 ① － 2 カラー（FITC/PE）分析の場合 －
（Ｔ細胞における各サイトカイン発現量の測定）
設定
- FS,SS,FL1,FL2 のパラメーターを選択します。（Gallios,Navios,FC500,XL の場合）
- 下図のようにプロット図を作成します。
| ①FS INT LIN/SS INT LIN | 細胞集団の位置を調整し、解析したい細胞集団にリージョンを作成します。 |
| ②FL1 LIN LOG/FL2 INT LOG | 蛍光補正と解析を行います。 |
| ③FL1 INT LOG | FITC の感度を調整します。 |
| ④FL2 INT LOG | PE の感度を調整します。 |
＜FITC（FL1）がPE（FL2）側に漏れ込みますので、補正を行います＞
【例】 Ｔ細胞における各サイトカイン発現量の測定
データ例 ② － 3 カラー（FITC/PE/PC5）分析の場合 －
（ヘルパーＴ細胞におけるTh1（IFN-γ＋）、Th2（IL-4＋）解析）
設定 （使用抗体：IFN-γ-FITC/IL-4-PE/CD4-PC5）
- FS,SS,FL1,FL2,FL4 のパラメーターを選択します。（Gallios,Navios,FC500,XL の場合）
- 下図のようにプロット図を作成します。（解析時に必要なプロット図は①②③です。）
| ①SS INT LIN/FS INT LIN | 細胞集団の位置を調整し、解析したい細胞集団にゲートを作成します。 |
| ②SS INT LIN/FL4 INT LOG | CD4 陽性細胞にゲートB を作成します。 |
| ③FL1 LIN LOG/FL2 INT LOG | 蛍光補正と解析を行います。 |
| ④FL1 LIN LOG/FL4 INT LOG | 蛍光補正を行います。 |
| ⑤FL2 LIN LOG/FL4 INT LOG | 蛍光補正を行います。 |
| ⑥FL1 INT LOG | PE の感度を調整します。 |
| ⑦FL2 INT LOG | 蛍光補正を行います。 |
| ⑧FL4 INT LOG | PC5 の感度を調整します。 |
（SS/FS のプロット図はUngated です。）
＜FITC（FL1）-PE（FL2）、PE-PC5（FL4）、FITC-PC5 について蛍光補正を行う＞
データ例 ③ － 3 カラー（FITC/PE/PC5）分析の場合 －
（メモリーＴ細胞 （CD45RO+）におけるTh1 メモリー細胞（IL-2+）解析）
設定 （使用抗体：CD45RO-FITC/IL-2-PE/CD4-PC5）
- FS,SS,FL1,FL2,FL4 のパラメーターを選択します。（Gallios,Navios,FC500,XL の場合）
- 下図のようにプロット図を作成します。（解析時に必要なプロット図は①②③です。）
| ①SS INT LIN/FS INT LIN | 細胞集団の位置を調整し、解析したい細胞集団にゲートを作成します。 |
| ②SS INT LIN/FL4 INT LOG | CD4 陽性細胞にゲートB を作成します。 |
| ③FL1 LIN LOG/FL2 INT LOG | 蛍光補正と解析を行います。 |
| ④FL1 LIN LOG/FL4 INT LOG | 蛍光補正を行います。 |
| ⑤FL2 LIN LOG/FL4 INT LOG | 蛍光補正を行います。 |
| ⑥FL1 INT LOG | FITC の感度を調整します。 |
| ⑦FL2 INT LOG | PE の感度を調整します。 |
| ⑧FL4 INT LOG | PC5 の感度を調整します。 |
（SS/FS のプロット図はUngated です。）
＜FITC（FL1）-PE（FL2）、PE-PC5（FL4）、FITC-PC5 について蛍光補正を行う＞
トラブルシューティング
細胞内サイトカインが検出できない場合は、以下の各項目を確認してください。
| 考えられる要因 | 確認事項 | 対処法 |
| 細胞が活性化していない | ① PMA、Ionomycin などの試薬の溶媒 ② インキュベーションの状態 ③ インキュベータ内でチューブの蓋はゆるめられているか？ ④ 採血時の抗凝固剤 ⑤ IL-4 の産生量 |
細胞の活性化に使用する PMA やIonomycin などの化学物質は溶解する溶媒が指定されています。指定の溶媒以外には溶解しませんので、“ 準備 ”の項で溶媒をご確認ください。 37℃、CO2 濃度5.0％に保たれているかどうか、ご確認ください。 インキュベーション中はCO2 によって、メディウムのpH が適した状態であることが必要です。CO2 の出入りができるように、チューブの蓋はゆるめてください。 採血には、ヘパリン抗凝固剤をお使いください。（“ 準備 ”の項参照） 正常サンプルでは IL-4 の産生量はもともと少なく、活性化した状態でも4％以下です。 |
| IntraPrep 試薬の反応状態が良くない | ① IntraPrep は室温で使用 ② サンプル量が適切かどうか？ ③ 特にReagent 2 の添加前に、細胞をよくほぐしたかどうか？ ④ 染色後の保存 |
IntraPrep は室温（18℃～25℃）保存です。反応も全て室温で行ってください（終了後、分析までの保存は 4℃）。 IntraPrep は、全血サンプルの場合は50 μL／テスト、 白血球数が多い場合、全血以外の検体の場合は白血球 5×105 個／テストで使用してください。それよりも サンプル数が多いと、反応が不十分になります。 Reagent 2 は膜透過処理試薬です。添加前に細胞をよくほぐし、試薬が均一に反応できるようにしてください。 全ての反応・染色終了後のサンプルは2～8℃、暗所で保存してください。 |
| 用いた抗体、または添加された抗体量が適当でない | ① 使用した抗体が細胞内サイトカインにも反応するかどうか？ ② 添加された抗体量が適切かどうか？ |
データシート等を確認し、細胞内サイトカイン分析に使用できることを確認してください。 IO テスト製品は20 μL／テストで使用してください。なお、各メーカーによって添加量が異なりますので、ご使用前に適当な抗体添加量を確認してください。 |
【細胞活性化の確認】
細胞がきちんと活性化されているかどうかを確認するためには、通常はCD25 やCD69 などの“活性化マーカー”を用います。しかし、このアッセイ系は産生されたサイトカインを細胞内に蓄積させるために、蛋白膜輸送を阻害する試薬Brefeldin A（またはMonensin）を使用しているため、“活性化マーカー”の発現も阻害されてしまい、活性化の確認に使用できません。そこでこのアッセイ系では、次のような方法で細胞の活性化を確認することをお勧めします。
- PMA、Ionomycin、Brefeldin A を含む活性化メディウムとは別に、Brefeldin A およびMonensin を除いた『活性化コントロールメディウム』を作製します。『活性化コントロールメディウム』にはBrefeldin A が含まれておりませんので、CD25やCD69 などの“活性化マーカー”を用いて、細胞が活性化されているかどうか（PMA、Ionomycin が作用しているかどうか）をチェックすることができます。
- 細胞が活性化すると、CD4 の発現がdown regulation することが知られています。非活性化細胞と活性化細胞のCD4の蛍光強度を比較することで、細胞の活性化をチェックすることができます。
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改訂履歴
Ver1.0 2006 年10 月
Ver1.1 2013 年 1 月
