植物の倍数体の解析

植物の倍数性を検定するために、染色体数を顕微鏡下で計数する方法は、長い時間と労力を要していましたが、フローサイトメトリーを利用することにより、非常に簡便に短時間かつ正確に測定を行うことが可能となりました。
フローサイトメトリーに使用するサンプルは単一な細胞の懸濁液でなければならないため、植物の場合はプロトプラストにする必要があり、その使用に制約がありました。ところが、1983年にGalbraithらの報告によって、植物をカミソリでChoppingすることにより細胞核を遊離させることで簡便に測定を行うことが可能となりました。
またこの方法により倍数体の解析のみならず、細胞周期やキメラ状態の解析を行う事が可能となります。



原理

植物細胞を染色液の中で chopping することにより、細胞核を遊離させ、DNA に特異的に結合する蛍光色素で遊離した核を染色し、その蛍光量からDNA 量を検出します。

蛍光色素は、DNA への結合様式でいくつかに分類されます。
以下に代表的な蛍光色素を示します。


色素名 結合様式 コメント 使用レーザー 蛍光
PI
(プロピジウムイオダオド)
DNA2重鎖への
Intercalation
DNA 含量によく相関 (空冷・水冷)
Arレーザー
(488 nm)
630 nm
7ADD
(7-アミノアクチノマイシンD)
G-C塩基対によく
結合
多重染色に用いられる (空冷・水冷)
Arレーザー
(488 nm)
655 nm
Hoechist33342
(ヘキスト33342)
A-T塩基対によく
結合
生細胞の DNA 染色可 水冷Arレーザー
(351~364 nm)
460 nm
TO-PRO-3 DNAに結合 多重染色に用いられる He-Neレーザー
(633 nm)
661 nm
DAPI A-T塩基対によく
結合
(488 nm)
蛍光顕微鏡観察によく用
いられる
水冷Arレーザー
(351~364 nm)
460 nm



サンプル調製

  1. 葉1 枚(2 cm2 以上)を用意します。
    (試験管内の葉は 2~3 枚、胚様体・カルスは5 mm3 以上)
  2. 中肋を除き、カミソリで切りやすい大きさにします。
    (試験管の葉はそのまま茎も含め使用)
  3. 6 cm シャーレにchopping Buffer 1.2 mL を加え、葉を湿らせます。
  4. カミソリで細かく刻みます。(新しい刀で細かくすることがポイント)
  5. chopping Buffer を0.6 mL 添加後、25 又は27 μmのステンレスメッシュを通します。
  6. 1.5 mL エッペンドルフチューブにサンプルを入れ保冷します。
  7. 1000 rpm,2 分間遠心し、上清を捨てます。
  8. chopping Buffer で500 μL にメスアップします。
  9. FCM にて測定

  10. 【chopping Buffer】
      1.0% Triton X-100
      140 mM 2-メルカプトエタノール
      50 mM NaHSO3 又は Na2SO3
      50 mM トリス塩酸(pH7.5)
      25 μg/mL PI

    “アリウム属に属する新規植物およびその育種・増殖法” 田上ら 特関平 7-50946 の方法による



    データ例

    みかんの倍数性の解析データです。図1は、2倍体のサンプルのデータです。
    図2は半数体~5倍体のヒストグラムデータを重ね書き表示したものです。


                       図1



                       図2
    九州東海大学農学部果樹園芸学教室 國武久登先生よりデータをご提供いただきました。


    上記の方法により柑橘類(ミカン、カラタチ、キンカン等)、ネギ属(ニラ、タマネギ、ワケギ、ネギ)、レタス、サツマイモ、アスパラガス、アルファルファ、シバ、ユリ、ツツジ、ツバキの花弁、シクラメン、イチゴなどで DNA 含量およびその倍数性が解析されています。



    参考文献

    三柴啓一郎三位正洋 :植物細胞への応用:細胞工学 Vol.17 No.4 1998