ハイスピードフローサイトメーターMoFloを用いた染色体分取

フローサイトメトリーによる染色体分類1、2（フローカリオタイピング）は、染色体異常3、4を分析するだけでなく、哺乳類の核型分析にも用いられています。有糸分裂細から染色体を調製する様々な染色体分離方法5～7が、フローカリオタイピングやフローソーティングのために開発されてきました。高精度なフローカリオタイピングを行うためには、デブリが少なく、単離した染色体を多く得られる良好な染色体サンプルを作る必要があります。
このため、二価陽イオン7（マグネシウムイオン）やカチオン性ポリアミン5（スペルミン、スペルミジン）などの安定化剤をIsolation bufferに使用するプロトコルが用いられてきました。分離した染色体は、1種類（ヨウ化プロピジウム、エチジウムブロマイド）または2種類のDNA特異的 蛍光色素（ヘキスト33258、クロモマイシンA3）で標識することにより、1パラメータ解析8～10または2パラメータ解析11、12のフローカリオタイピングを行うことができます。
高度に純化された染色体画分は、ハイスピードフローサイトメーター MoFloを用いて、迅速に単離することが可能です。



材料と方法

染色体の調製と染色

0.1μg/mLのデメコルシンを用い、有糸分裂細胞の割合が最大となる至適時間（例えば、リンパ芽球様細胞株の場合は約6時間）にて、細胞をM期で停止させます。遠心（289×g、5分間）し上清を除去したペレットに、低張性KClバッファを添加して、室温で10分間再懸濁します。遠心（289×g、5分間）し上清を除去したペレットを、氷冷したポリアミン分離バッファ5に再懸濁し、20秒間攪拌します。染色体懸濁液を200×gで2分間遠心し、上澄みを20μmのメッシュフィルタにてろ過し、5μg/mLのヘキスト33258、40μg/mLのクロモマイシンA3および10mMのMgSO4を添加し、オーバーナイトで染色します。フロー解析の1時間前に、染色した染色体懸濁液に、10mMのクエン酸ナトリウムと25mM亜硫酸ナトリウムを加えます。

機器のセットアップ

染色した染色体懸濁液を、2つの水冷アルゴンイオンレーザを搭載したMoFloにて解析します。第1レーザは、ヘキスト33258を励起させるために、マルチラインUV（330～360nm）を出力するように調整し、第2レーザは、クロモマイシンA3を励起させるために、波長457nmを出力するように調整します。両レーザの出力を300mWに設定します。トリガーシグナルは、ヘキスト33258蛍光にします。前方散乱光（FSC）には351/10nmバンドパスフィルタ、ヘキスト33258蛍光は400nmロングパスフィルタと480nmショートパスフィルタ、クロモマイシンA3蛍光は、490nmロングパスフィルタを用いて検出します。MoFloは、各蛍光パラメータと前方散乱光が最小のCVになるよう、3μm蛍光ビーズを用いて、あらかじめ調整しておきます。70μmのCytonozzleチップを使用し、シース圧を約60 psi、drop drive frequencyを約95 KHzに設定し、高速ソーティングに設定します。さらに、4Way™ Sort上で、1ドロップエンベロープ当たり1モードの高純度ソートオプションを選択します。

解析とソーティング

1,000イベント/秒の速度で、合計100,000イベントのデータを取得し、Summitソフトウエアで解析します。デブリと凝集を除くため、前方散乱が小さく、かつヘキスト33258蛍光の高い領域にゲートしたヘキスト33258とクロモマイシンA3蛍光（図1） の2パラメータフローカリオグラムのデータを示します。

染色体の分取を行うため、2パラメータフローカリオグラム（図2）上で染色体クラスターにソートゲートを作成し、Sort LogicEditorを用いてソートディシジョンを設定し、必要な数の染色体をコレクションバイアルに分取します。


図1
正常ヒト細胞株の2パラメータフローカリオタイプ。染色体をヘキスト33258とクロモマイシンA3で染色した。各染色体型の位置が示されています。Summitソフトウエアにて解析、スムージングをかけて表示。スムージング法：ガウス分布、パス数=2。



考察

MoFlo High-Performance Cell Sorter により、哺乳類の細胞株由来の染色体のフローカリオタイピングと特定の染色体の精製が可能となります。MoFloのソーティング設定は、高純度で迅速な染色体分離が行えるようにカスタマイズすることが可能です。MoFloを用いることにより、染色体ピークの良好な分離を保ったまま、染色体サンプルを1秒間に約8,000～12,000イベントで、ソーティングできます。ソーティングされた染色体からDNAや蛋白を抽出でき、ゲノミクス研究13～15やプロテオミクス研究16に使用できます。


図2
第2染色体と第17染色体の間で転座があったヒト細胞株の、ヘキスト33258蛍光とクロモマイシンA3蛍光の2パラメータプロット。ソートゲートは、転座染色体である派生染色体2（R1）と17（R4）、そしてその正常染色体である第2染色体（R2）と第17染色体（R3）上に設定されています。Summitソフトウエアにて解析、スムージングをかけて表示。スムージング法：ガウス分布、パス数=2。



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