ハイスピードフローサイトメーターMoFloを用いた幹細胞分取

機能的幹細胞集団の単離は、幹細胞の生態理解、臨床的な移植のどちらにおいても、生物学、医学にとって非常に興味深い事柄です。造血系・非造血系幹細胞の双方について、表現型マーカー、機能的特性およびin vivoでの再構成能を同定する研究が行われています。
歴史的には、これらの多能性幹細胞を捉えることが実験を行ううえでの大きな課題でした。例えば移植プログラムにおいては、通常、刺激したドナー由来の末梢血幹細胞は白血球の0.01～0.1％、骨髄の幹細胞は0.5～5％です1。これらの細胞の純化には、マルチパラメータ　イムノフェノタイピングや、機能特性とイムノフェノタイピングの組み合わせによるハイスループットフローサイトメトリーなど、多くの方法が行われてきました。

ハイスピードフローサイトメーター MoFloは、このような実験系で非常に有用であることが示されています。以下に、MoFloで骨髄SP細胞（side population）を純化した例を示します。



材料と方法

染色

5～8週齢C57BL/6マウスの脛骨および大腿より採取した骨髄をHBSSに懸濁しました（ポリプロピレン製遠心チューブに分注）。この懸濁液に含まれる有核細胞の数を計数しました。このサンプルを遠沈し、あらかじめ温めておいたDMEMで1×106 cells/mLになるよう再懸濁しました。最終濃度が5μg/mLとなるようHoechst33342を添加後、サンプルをよく混和し、ウォーターバスで37℃にて正確に90分間インキュベーションしました。インキュベーション後、すぐに4℃で遠心し、ペレットを冷HBSSに再懸濁して4℃で保存しました（追加で表面抗体標識を行う場合には、細胞懸濁液が4℃に保った状態であることを確認してください。必要に応じて、ヨウ化プロピジウム2μg/mLを加えて、ソートから非生存細胞を除外します2）。

機器のセットアップ

351nm UVレーザ搭載MoFloを用いて、青色蛍光を450/20バンドパスで、赤色蛍光を675 LPフィルターで検出しました。



結果

前方散乱光と側方散乱光のドットプロットで、細胞集団をゲーティングしました（図1a）。目的の前駆細胞は、HoechstBlueとHoechst Redのドットプロットで主な細胞集団の左方にあたる特徴的な位置、すなわちside populationの位置に認められます（図1b）。これらの希少なSP細胞（Hoechst流出能を有する造血幹細胞の一タイプ）を、詳細に調べるために分取しました。



考察

SP細胞を含む16～27造血幹細胞および非造血幹細胞集団の純化は3～15、MoFloでルーチン化することができます。MoFloの革新的な電気・光学・流体学的な技術は、これらの希少なイベントを捉えるのに必要な正確性および回収率を提供します。さらにMoFloは、特許技術であるノズルデザインにより、細胞の乱れを抑え、細胞への加速の影響を最小化します。これにより、純化後もこれらの細胞の機能は保たれ、in vivoでの再構成、移植後生着及び長期培養が可能になります28～34。


(左から）
図1a 前方散乱光vs 側方散乱光のドットプロット図により、目的の細胞集団を確認します

図1b ゲーティング後、目的の前駆細胞は主な細胞集団の左方に認められます



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    35. 謝辞

    本稿に使用したデータおよびプロトコルをご提供いただいた、Karen Helm先生（コロラド大学ヘルスサイエンスセンター所属）、Margaret Goodell博士（ベイラー医科大学細胞・遺伝子治療センター所属）に御礼申し上げます。