1. ① 7-AAD negative（生細胞）の細胞集団にVIABLEリージョンをセットします。左端（7-AAD陰性側）や上下端を枠いっぱいまで囲むようにします。
2. ② デブリスや血小板を含まないようにLEUKSリージョンのCD45側下限をセットし、CD45陽性の白血球全体を囲みます。上端（SS高値側）は枠いっぱいまで囲んでください。このプロット図はドットプロットになっており、CD34+HPCが赤く表示されているので、LEUKSリージョン内に含まれていることをご確認ください。LYMPHSリージョンをリンパ球領域にセットします（⑥で利用）。
3. ③ CD34陽性細胞集団にCD34 POSリージョンをセットします。CD34の下限を下げ過ぎると、成熟リンパ球や成熟単球の混入が増えるのでご注意ください。
4. ④ CD45弱陽性(Dim)の集団にCD45 DIMリージョンをセットします。③のCD34 POSリージョンでCD34下限値を下げ過ぎると成熟細胞の混入が増えますので、③のリージョンセットを変更するか、成熟細胞を含まないようにCD45 DIMリージョンをセットしてください。
5. ⑤ FS/SSプロット図で形態的な特徴から造血幹細胞にCD34+HPCリージョンをセットします。
   (CD34+HPCの絶対数が報告値となります。) まれに出現するデブリスや血小板凝集集団を除外しやすいように、リージョンの左上端は斜めにしてあります。
6. ⑥ また、別なFS/SSプロット図に②でLYMPHSリージョンをセットした成熟リンパ球が描写されています。FS LYMPHリージョンは上記のCD34+HPCリージョンとリンクされており、同じ形を形成しますので、FS下限値側を上げすぎて、成熟リンパ球をカットしていないか等の確認を行います。
7. ⑦ CD45/CD34プロット図右上の絶対数測定用ビーズ（Stem-Count Beads）にBEADSリージョンをセットします。
   4分割リージョンはゲーティングには利用しませんが、CD34陽性細胞（緑円の集団）のCD45側の下限値と②のCD45/SSプロット図におけるLEUKSリージョンのCD45側下限値を比較することにより、LEUKSリージョンにおいてCD45弱陽性のCD34陽性細胞集団（CD45/SSの赤表示集団）をカットしていないかの確認に利用できます。
8. ⑧ 時間/蛍光のプロット図に⑦でBEADSリージョンをセットした蛍光ビーズが表示されています。Single Beads集団のみにCALリージョンをセットします。この際、リージョンの左端が一番左側(TIMEの0チャンネル)になるようにセットしてください。
   Y軸側でやや高い位置にわずかに認められるダブレットのビーズ集団は、リージョンに含めません。

注： 「Stem-Trol 回収率の測定」の際には、①でVIABLEリージョンを右端いっぱいまで囲むようにします。Stem-Trol は固定細胞のため、死細胞と同様、7-AAD 陽性となります。

測定データ解析方法 －他社フローサイトメーターの場合－

以下の手順でデータ解析を行ってください。 （例：B-D FACSCalibur、CELLQuest で解析）

計算・判定方法

1. Stem-Trol の回収率

例）#テストチューブ ； CD34①（試験管①の#CD34＝Stem‒Trol＋正常末梢血のCD34+細胞＋非特異的結合） ＝245個／μL　

#コントロールチューブ ； （試験管②の#CONTROL＝非特異的結合）＝ 3個／μL

Stem‒Trol回収率(%)＝5x（テストチューブｰコントロールチューブ）ｘ100
           Stem－TROLアッセイ値
※校正値は、試薬バイアル瓶に貼付されているラベルに記載されています（*1250個／μL（Lotにより異なります））

                    許容範囲内ですので、検体サンプルの測定を行います。

Stem-Trol の回収細胞率(%)が85～115％の範囲であれば測定系には問題ないと判断し、検体の測定・解析を行ってください。
この範囲に入らないときは、測定系に異常や誤り等がないか見直した後、もう1 度サンプル処理～測定を行ってください。

NaviosEX/Naviosを使用している場合
各チューブ内の CD34 陽性細胞絶対数は、あらかじめStem-Count の校正値を入力しておくことで、自動的に計算されます。

StemTrol 回収率を計算し、85～115％の範囲内に入っていることを確認します。

DxFLEXを使用している場合

各チューブ内のCD34陽性細胞絶対数はあらかじめStem-Countの」校正値を入力しておくことで、自動計算されます。

NaviosEX/Navios以外のFCMを使用している場合

1. NaviosEX/Navios 以外のFCM の場合は、Stem Cell のリージョンとStem-Count のリージョンのそれぞれのEvent 数（Count）から次式により絶対数を算出します。
   
   

   CD34 絶対数（／μL）＝ Stem Cellﾘｰｼﾞｮﾝの Events ×Stem-Count 校正値*
               Stem-CountﾘｰｼﾞｮﾝのEvents *製品能書に記載

2. 1で算出した試験管①及び②のCD34 絶対数からStem-Trol の回収率を計算します。
   
   

   ・ 試験管①の CD34 絶対数から試験管②のCD34 絶対数を差し引き、換算ファクタ（Stem-Count とStem-Trolの添加量の比＝ 100μL／20μL ＝ ５）をかけます。

   ・ 次式により、Stem-Trol の回収率を計算します。
   Stem-Trol 回収率(%)＝ ５ x (試験管① CD34 細胞数－試験管② CD34 細胞数) ×100
                     Stem-Trol 校正値 *

*製品能書に記載

2. 検体サンプル

NaviosEX/Naviosを使用している場合

＜検体中のCD34 陽性細胞数の求め方＞
StemTrol 回収率確認の場合と同様に、各テストチューブ内のCD34 陽性細胞絶対数を求めます。
次に、下記手順にしたがって非特異結合分を差し引いた、真の CD34 陽性細胞絶対数を算出します。

CD34 陽性細胞絶対数の計算方法

試験管 Ⓐ中の#CD34=25 個／μL、試験管Ⓑ中の#CD34=23 個／μL
両試験管での平均値をとると、（25＋23）×1／2＝24 個／μL
試験管Ⓒ（コントロール）中の# 非特異的結合＝2 個／μL
従って、検体中の#CD34＝24－2＝22 個／μＬ

NaviosEX/Navios以外のFCMを使用している場合
EPICS XL およびCytomics FC500 以外のFCM の場合は、StemTrol 回収率確認の場合と同様にStem Cell のリージョンとStem-Count のリージョンのそれぞれのEvent 数（Count）から次式により絶対数を算出します。

CD34 絶対数（／μL）＝StemCell リージョンの Events　× Stem-Count 校正値*
  （#CD34）    Stem-Count リージョンの Events

*製品能書に記載

上記「a. EPICS XL SystemⅡ, EPICS XL EXPO32ADCおよびCytomics FC500使用の場合」と同様に、非特異結合分を差し引いた、真のCD34陽性細胞絶対数を算出します。

参考文献

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13. [442] Chin-Yee, I., Keeney, M., Anderson, L., Nayar, R., Sutherland, D.R., "Current status of CD34+ cell analysis by flow cytometry: the ISHAGE guidelines", 1997, Clin. Immunol. Newsletter, 17, 2-3, 22-29.