Stem-Kitを用いたCD34+造血幹細胞絶対数測定
末梢血幹細胞移植(PBSCT)において、CD34陽性細胞数は、比較的簡便に測定しうることから、造血幹細胞／前駆細胞数の指標としてよく用いられています。移植細胞中の造血幹細胞／前駆細胞の数は、移植の成否に直接関わるため、CD34陽性細胞数を正確に知ることは臨床的にも重要であり、測定試薬のキット化や、関連学会（国際血液療法・移植学会－ISHAGE、現ISCT）のガイドラインを代表とする標準化など、測定値の施設間差の解消に向けた努力がなされています。
ベックマン・コールター社のStem-Kitは、造血幹細胞測定をするための試薬 （CD34抗体、CD45抗体、生死判別試薬7-AAD、内部標準ビーズ）と、ISCTガイドラインで推奨されている多段階階層化ゲーティング法に加えて、独自に開発したStem-Trol(CD34陽性コントロール細胞)を用いて機器設定や試薬・操作上のトラブルをチェックすることにより精度管理も万全に行えます。 さらに同サンプルを2回分測定できる量の試薬がセットされており、重複測定による精密なデータを得ることができます。
参考：臍帯血と幹細胞移植
臍帯（へその緒）は造血幹細胞を豊富に含み、白血病や再生不良性貧血の治療に用いられる。臍帯血移植は、国内では1994年に東海大学付属病院が最初に実施したとされる。採取できる幹細胞の量は限られるが、ドナー（細胞提供者）の負担がほとんどなく、HLAが完全に一致しなくても、移植できる（2座不一致でも可能）。1995年以降、採取した臍帯血を保存し、移植を待つ患者に斡旋する臍帯血バンクが各地に設立され、現在は11バンクが活動している。1999年には、全国のバンクの情報を一元管理する日本さい帯血バンクネットワークもスタートした。2007年までに臍帯血移植は約4300例が実施されたが、採取できる医療機関はわずか100余り。現在、保存されている臍帯血は、3万本。胎盤が出てくる前に、へその緒の静脈に針を刺しバッグに採取して、3分間ほどで完了する。バンクにて検査をして精製した後、液体窒素でマイナス196度にて半永久的に保存される。CD34陽性の造血幹細胞数が基準で8億個以上必要である。10億個以上あれば、大人にも処置することができる。足りない場合は、研究に使用される。
一方、骨髄バンクのドナー登録者数は30万人に到達した。理論的には、9割の患者のHLAに適合するという。しかし、骨髄穿刺などドナーに負担の多い骨髄移植は、健康上や都合がつかないといったドナー側の理由で、約半数近くが中断される。近年、ドナーの負担の少ない末梢血幹細胞移植(PBSCT)が開発されたが、事前に造血幹細胞の増殖（動員）を促す製剤の安全性などの問題で、血縁者間または自己（患者）のみに行われている。
2007年の国内での骨髄移植実施数は、約1000例あり、臍帯血移植実施数は、急速に伸ばして約800例である。
ベックマン・コールターは、国際細胞療法学会ISCTのCD34陽性細胞数測定ガイドラインに準拠した世界で初めての造血幹細胞数測定キットstem Kitを10年前に開発し、造血幹細胞移植の大切な検査の啓蒙や実施に長年貢献している。
Stem-Kit による検体測定までの流れ
Stem-Kit（50テスト）構成試薬および必要な試薬
● Stem-Kit CD34 HPC Enumeration Kit 製品番号：A15573（IM3630×1+IM3632×2）
● StemComp（製品番号：IM3631）またはCD8-FITC/CD4-PE（製品番号：IM1379） －蛍光補正用－
必要に応じて
● Coulter Stem-Trol Control Cells（製品番号：IM3632） －補充用－
Stem-Kit による検体測定までの流れ
ISHAGE（国際血液療法・移植学会）プロトコルの測定方法に準拠
・キットで使用しているCD34 classⅢ（581）及びCD45(J33)は、ISHAGE CD34 測定プロトコルでも推奨されているクローンで、S/N 比が高く、わずかなCD34 陽性、CD45 弱陽性細胞集団を確実に見出すことができます。
・ Isoclonic Control （図参照）を使うことにより、効果的にCD34 陽性細胞リージョン内の「偽陽性細胞」を除くことができ、ゲーティングの誤差による測定値の変動を少なくすることができます。
・ 検体として新鮮アフェレーシス検体、全血、臍帯血、及び骨髄検体に使用できます。7-AAD の使用により、凍結保存検体にも使用可能です。
◆ 造血幹細胞数測定に必要な試薬がセットになっており、抗体試薬（2 カラー）は調製済です（Ready for use）。
◆ 内部標準ビーズ法によるシングルプラットフォーム測定
絶対数が既知の Stem-Count を直接検体の中に入れて測定し、ビーズと細胞の数を比率計算します。
※FCM によるCD34 陽性細胞陽性率と血球計算機のデータからCD34 陽性細胞数を算出する方法をデュアルプラットフォーム測定と呼びます。
◆ 同一検体から調製した検体を重複測定し、その平均値を採用
同じテストサンプルを 2 本用意し、重複（繰り返し）測定します。２つの結果がかけ離れた結果でないかどうかを確認し、その平均値を採用します。Stem-Kit には、重複測定分の抗体がセットになっています。
◆ 細胞のロスを防ぐため、No-wash 法
◆ CD34 陽性コントロール細胞Stem-Trol を付属
Stem-Trol は、KG1a 細胞を長期安定化処理したCD34 陽性コントロール細胞です。あらかじめアッセイ値が明記されていますので、測定方法の正確度を評価し、精度管理ができます。
精度管理について
＜CD34＋細胞絶対数測定における誤差要因＞
検体が手元に届いてから、正確なCD34＋細胞数測定に至るまでには、上記に示すような様々な誤差要因が存在します。正確にCD34＋細胞数測定をするためには、こうした誤差要因をできる限り排除して標準化された方法に従うことが重要です。また、その結果を客観的に評価し継続的な改善を行なうことが精度管理の基本的な考え方です。
検体の採取方法や保存方法、測定時におけるゲーティング方法については、ISHAGE＜国際血液療法・移植学会＞の示すガイドラインや自施設内での作業標準書の整備によって標準化することが可能です。一方サンプル処理における試薬の状態や反応条件（温度、時間）、手技、機器の状態や設定については、プロセスコントロールを用いて確認する方法が一般的です。
＜Stem-Trol＞ は正常末梢血に加えることでプロセスコントロールとしての使用が可能なCD34 陽性細胞です。これを用いて検体と同様にサンプル調製し、コントロール細胞数（回収率）をカウントすることにより、試薬や反応条件の適切さとともに、先に述べた標準化の効果を確認することができます。
Stem-Kit による精度管理操作手順（ダイジェスト）
Ⅵ. Stem-Kit 使用手順
1. 精度管理のためのStem-Trol 処理手順
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1） 試験管の準備 試験管２本を用意し、 |
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2） 抗体の分注 準備した試験管に 各抗体を 20μL |
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3） 7-AAD の添加 7-AAD を20μL ずつ添加します。 |
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4） 正常末梢血の分注 各々の試験管に 正常末梢血を 100μL 加えます。 |
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5） Stem-Trol 添加 ①と②の試験管によく攪拌したStem-Trol を20μL 加えま |
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6） 抗体のインキュベーション 室温、暗所で 20 分間インキュベーションします。 |
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7） 溶血剤の添加 1×Lysing Solution（10×Lysing Solution：蒸留水＝1： |
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8） Stem-Count の添加 室温に戻したStem-Count を泡立たないように注意しなが |
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9） 測定 測定直前に攪拌し、フローサイトメーターで分析します。 |
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CD34 回収細胞数 [#CD34tube①－#CD34tube②] が
Stem-Trol アッセイ値±15％以内ならOK！
2. 検体サンプル処理手順
・Stem-Kit では、検体サンプルを重複測定し、それぞれの平均値を採用することでより精密なデータを取得することを推奨しています。
・Stem-Kit の対象検体は、新鮮（採取後24 時間以内）アフェレーシス検体、末梢血、臍帯血、及び骨髄検体です。
分離した CD34 陽性細胞については、添付のLysing Solution の代わりにHank’s BSS（5％FCS 含む）に浮遊させて測定してください。
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1） 試験管の準備 試験管を 1 検体につき３本用意し、それぞれ |
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2） 抗体の分注 1）で準備した試験管に各抗体を 20μL分注します。 |
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3） 7-AAD の添加 7-AAD を20μL ずつ添加します。 |
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4） 検体の分注 各々の試験管に検体を 100μL 加えます。 |
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5） 抗体のインキュベーション 室温、暗所で 20 分間インキュベーションします。 |
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6） 溶血剤の添加 1×Lysing Solution（10×Lysing Solution：蒸留水＝1： |
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7） Stem-Count の添加 室温に戻したStem-Count を泡立たないようによく攪拌 |
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8） 測定 測定直前に攪拌し、FCM で分析します。 |
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測定データ解析方法
ここでは EPICS XL SYSTEMⅡのヒストグラム例を元に説明していますが、EPICS XL EXPO32 ADC およびCytomicsFC500 RXP/CXP で測定の場合も、同様のプロトコルを設定することで解析可能です。
「Stem-Trol の回収率の測定」及び「検体の測定」ともに下記プロトコルに従って行います。
CD45 陽性細胞集団全体（造血幹細胞を含む白血球）にリージョンAを設定します。
ヒストグラム２～４のゲートにA を設定します。
リンパ球領域にリージョンＩを設定し、ヒストグラム６にＩゲートを設定します。
CD34 陽性かつ低SS 強度の細胞にリージョンB を設定します。
ヒストグラム 3，4 のゲートをAB（A かつB）に設定します。
このヒストグラムでカウント数を75,000 に設定します。
CD45 が強陽性の細胞集団[非特異反応を示す白血球（リンパ球または単球）]を含まないようにリージョンC を設定します。
ヒストグラム４のゲートを ABC（AかつB かつC）に設定します。
顆粒球やデブリを含まないようにリージョンD を設定します。
このリージョンD（A かつB かつC かつD）がStem Cell のリージョンになります。
リージョンＢ中の細胞がCD34＋／CD45dim かどうかを確認します。Stem-Count にリージョンＨを設定します。
リージョン D をコピーして細胞数測定のためのリージョンがディスクリミネーターで切られていないかどうかを確認します。
Stem-Count ビーズの部分にリージョンＧを設定し、リージョン名を「CAL」と入力します。
※ EXPO32 またはRXP/CXPの場合、ヒストグラム上に「CAL」と表示されます。
また、ビーズが安定して流れているかどうかを確認します。
７-AAD に染色されない細胞群（生細胞）にリージョンJ を設定します。
ヒストグラム１～４にゲートJ を設定します。
注： 「Stem-Trol 回収率の測定」の際には、ヒストグラム１～４のゲートJ を外してください。Stem-Trol は固定細胞のため、死細胞と同様、7-AAD 陽性となります。
―感度および蛍光補正（Compensation）値の確認―
Stem-Kit を用いた幹細胞測定は、FITC（CD45）/PE（CD34）/７－AAD（死細胞）の３カラー測定を行うため、正しく測定するためには各検出器の感度設定および蛍光補正（Compensation）の調整が重要です。
下記の要領に従って、定期的に感度および蛍光補正値を確認し、必要に応じて下図のようになるように調整を行ってください。
1. サンプル調製
1） 試験管に正常ヒト末梢血 100μL を分注します。
2） Stem-Trol 20μL を添加します。
3） IM3631（StemCOMP）またはIM1379(CD8-FITC/CD4-PE)を20μL 添加します。
4） ７-AAD を20μL 添加します。
5） 試験管をよく撹拌して混合します。
6） 室温、暗所で 20 分間インキュベーションします。
7） 溶血剤（Stem-Kit 付属、用時10倍希釈）を２ｍL添加し、室温、暗所で10分間インキュベーションします。
8） 測定します。
2. 測定
FS およびSS の感度を設定し、リンパ球領域にリージョンA、リンパ球+Stem-Trol の領域にリージョンB を設定します。
ヒストグラム２には、ゲートA を、ヒストグラム３、４にはゲートB を設定します。
測定データ解析方法 －他社フローサイトメーターの場合－
以下の手順でデータ解析を行ってください。 （例：B-D FACSCalibur、CELLQuest で解析）
FL1/SSC Dot Plot 上でCD45陽性細胞集団全体（造血幹細胞を含む白血球）にR1 を設定します。
リンパ球領域に R5 を設定します。
FL2/SSC Dot Plot 上でCD34陽性かつ低SS 強度の細胞にR2 を設定します。
この Dot Plot のゲートをR1 に設定します。
この Dot Plot で75,000 以上カウントします。
FL1/SSC Dot Plot 上でCD45が強陽性の細胞集団[非特異反応を示す白血球（リンパ球または単球）]を含まないようにR3を設定します。
この Dot Plot のゲートをR1 かつR2 に設定します。
FSC/SSC Dot Plot 上で顆粒球やデブリを含まないようにR4 を設定します。
この R4 がStem Cell のリージョンになります。
この Dot Plot のゲートをR1 かつR2 かつR3 に設定します。
R2 中の細胞がCD34＋／CD45dim かどうかを確認します。
このヒストグラム のStem-Count にR8 を設定します。
R4 をコピーして細胞数測定のためのリージョンがディスクリミネータで切られていないかどうかを確認します。
この Dot Plot のゲートをR5 に設定します。
Stem-Count の位置にR7 を設定します。
死細胞の除去を行う場合は、ヒストグラム８にSSC/FL3 Dot Plot を作成します。
生細胞（7-AAD-）にリージョンR9を設定し、ヒストグラム１～４にゲートR9 も設定します。
計算・判定方法
1. Stem-Trol の回収率
a. EPICS XL SystemⅡ使用の場合
各チューブ内の CD34 陽性細胞絶対数は、あらかじめStem-Count の校正値を入力しておくことで、自動的に出力されます。
#CD34①（試験管①の#CD34＝Stem-Trol＋正常末梢血のCD34+細胞＋非特異的結合）
＝230 個／μL （下記測定データプリントアウト例、リージョンD のCount）
#CONTROL（試験管②の#CONTROL＝非特異的結合）＝3 個／μL* *試験管②の測定データプリントアウト例は省略
Stem-Trol 回収率(%)＝ 5 x (試験管① CD34 細胞数－試験管② 非特異的結合数) x100
Stem-Trol アッセイ値 **
（**1152 個／μL（Lot により異なります））
＝ 5 ｘ (230 – 3) ｘ 100 ＝ 98.5%
1152
許容範囲内ですので、検体サンプルの測定を行います。
Stem-Trol の回収細胞率(%)が85～115％の範囲であれば測定系には問題ないと判断し、検体の測定・解析を行ってください。
この範囲に入らないときは、測定系に異常や誤り等がないか見直した後、もう1 度サンプル処理～測定を行ってください。
Stem-Count 校正値の設定 （EPICS XL SystemⅡの場合）
●「Protocol」スクリーンから、Select に入ります。
● 「Setup Screen」の中の、「Protocols」を選択します。
● 右下四角の中の、一番下「Statistics Select」をクリックします。
● 左下 CAL FACTOR ****をクリックします。
● Stem-Count のラベルに記載してある絶対数を確認して、その数を手入力し、Enter を押します。
● Okay をクリックします。
● Save Change to file? Y と聞いてきますので、Enter を押します。
●「Setup Screen」の中の「Run」を選択します。
これで、Stem-Count 値の設定は終了です。
b. EPICS XL EXPO32 ADC およびCytomics FC500 RXP/CXP の場合
各チューブ内の CD34 陽性細胞絶対数は、あらかじめStem-Count の校正値を入力しておくことで、自動的に計算されます。
SystemⅡの場合と同様にして、StemTrol 回収率を計算し、85～115％の範囲内に入っていることを確認します。
c. EPICS XL およびCytomics FC500 以外のFCM を使用している場合
- EPICS XL およびCytomics FC500 以外のFCM の場合は、Stem Cell のリージョンとStem-Count のリージョンのそれぞれのEvent 数（Count）から次式により絶対数を算出します。
CD34 絶対数（／μL）＝ Stem Cellﾘｰｼﾞｮﾝの Events ×Stem-Count 校正値*
Stem-CountﾘｰｼﾞｮﾝのEvents *製品能書に記載 - 1で算出した試験管①及び②のCD34 絶対数からStem-Trol の回収率を計算します。
・ 試験管①の CD34 絶対数から試験管②のCD34 絶対数を差し引き、換算ファクタ（Stem-Count とStem-Trolの添加量の比＝ 100μL／20μL ＝ ５）をかけます。
・ 次式により、Stem-Trol の回収率を計算します。
Stem-Trol 回収率(%)＝ ５ x (試験管① CD34 細胞数－試験管② CD34 細胞数) ×100
Stem-Trol 校正値 *
*製品能書に記載
2. 検体サンプル
a. EPICS XL SystemⅡ, EPICS XL EXPO32ADC およびCytomics FC500 使用の場合
＜検体中のCD34 陽性細胞数の求め方＞
StemTrol 回収率確認の場合と同様に、各テストチューブ内のCD34 陽性細胞絶対数を求めます。
次に、下記手順にしたがって非特異結合分を差し引いた、真の CD34 陽性細胞絶対数を算出します。
CD34 陽性細胞絶対数の計算方法
試験管 Ⓐ中の#CD34=25 個／μL、試験管Ⓑ中の#CD34=23 個／μL
両試験管での平均値をとると、（25＋23）×1／2＝24 個／μL
試験管Ⓒ（コントロール）中の# 非特異的結合＝2 個／μL
従って、検体中の#CD34＝24－2＝22 個／μＬ
b. EPICS XL およびCytomics FC500 以外のFCM を使用している場合
EPICS XL およびCytomics FC500 以外のFCM の場合は、StemTrol 回収率確認の場合と同様にStem Cell のリージョンとStem-Count のリージョンのそれぞれのEvent 数（Count）から次式により絶対数を算出します。
CD34 絶対数（／μL）＝StemCell リージョンの Events × Stem-Count 校正値*
（#CD34） Stem-Count リージョンの Events
*製品能書に記載
上記「a. EPICS XL SystemⅡ, EPICS XL EXPO32ADCおよびCytomics FC500使用の場合」と同様に、非特異結合分を差し引いた、真のCD34陽性細胞絶対数を算出します。
参考文献
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