Biomek i7ハイブリッド・加圧・遠心分離インテグレーションシステムによるビタミンD測定前処理の自動化

Kerstin Thurow¹, Heidi Fleischer¹, Anna Bach¹, Bhagya Wijayawardena², Miranda Kheradmand^2
1Center for Life Science Automation, University Rostock, Rostock, Germany
²Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, Indiana, United States

概要

ビタミンDは代謝に重要な要素であり、骨に関係する疾患の予防と治療に効果があり、代謝状態を把握するために、血漿中のビタミンDを測定します。ビタミンＤ検査法で最も一般的なのは、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）による測定です。LC/MSは、幅広い物質を頑健で正確、かつ高感度に検出できるパワフルなツールです。しかし、LC/MS分析のためのサンプル前処理には時間が掛かり、人的ミスが起こりやすいという問題があります。サンプル前処理を自動化することで、人的ミスとアクティブベンチタイムを減らし、再現性を向上させることが可能です。本アプリケーションノートでは、Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いたビタミンＤ測定用サンプル前処理の自動化を検証します。

はじめに

ビタミンDは脂溶性ビタミンの一つで、ステロイドのサブクラスであるセコステロイドの一種であり、カルシウムの代謝に生理学上重要な役割を果たしていることでよく知られています。ビタミンDでもっとも重要なのがD₂とD₃です。皮膚に紫外線のUV-B波（ドルノ線）が当たると、7-デヒドロコレステロールが変換され、ビタミンD₃（コレカルシフェロール）が生成されます。ビタミンD₂（エルゴカルシフェロール）は、ビタミンD₃に変換が可能です。ビタミンDはプロホルモンとしても機能し、中間体からカルシトリオールとして知られる活性ステロイドホルモンに変わります。ビタミンDは、血中カルシウム濃度の調節と骨の形成に重要な役割を果たします。例えば、ビタミンDの欠乏は、中期的に小児におけるくる病、成人では骨軟化症の原因となります。急性または慢性のビタミンＤ過剰摂取は、ビタミンＤ過剰症につながり、最悪の場合、生命にかかわる深刻な合併症を引き起こします。ビタミンＤ欠乏の健康への影響を理解することが、最近の科学研究のテーマとして注目されています¹ 。

血中ビタミンD濃度の測定において最も重要な値は、25‐ヒドロキシビタミンD₃（25-Hydroxy-vitamin D₃：25（OH）D₃、カルシジオール）です。ビタミンD₃は、まず、肝臓で、血中を循環するビタミンDの形態である25（H）D₃に変換されます。その後、腎臓で活性型ビタミンDホルモンのカルシトリオールに変換されます（Figure 1参照）。25（OH）D₃は活性型ビタミンD₃の不活性型前駆体で、ビタミンD濃度測定のマーカーとして使用されます³ 。

Figure 1. ビタミンＤの形態変換

液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）は、ビタミンＤ濃度測定に最も一般的に使用される方法です。ビタミンＤ分析は、通常、血清か血漿で行います。マトリクスの種類に応じて、分析の対象物質をマトリクス成分から分離するために、異なるサンプル前処理が必要です。マトリクスは複雑であるため、サンプル前処理の工程は、タンパク質沈殿や抽出プロセスなども含め、広範囲に及びます。本アプロケーションノートでは、血清ビタミンDをLC/MS分析により測定するためのサンプル前処理を、Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いて自動化しました。自動化したサンプル処理には、遠心分離機、加圧固相抽出装置も含みます。

Figure 2. サンプル前処理ワークフロー。LC/MS分析を除く全てのステップを、周辺デバイスをインテグレーションしたBiomek i7ハイブリッドワークステーションで行った。

方法

検証は、公開されている固相抽出によるビタミンD代謝物測定方法を参照して行いました⁴。メソッド開発と評価には、ブタ血清を使用しました。血液サンプルはLeibniz Institute for Farm Animal Biology（FBN, Dummerstorf, DE）およびState Office for Agriculture, Food Safety and Fishing（LALLF, Rostock, DE）より入手しました。本実験で使用した25-OH-Vitamin D₂および25-OH-Vitamin D₃を含有する試薬は、血清キャリブレーターとコントロールを含め、試薬メーカーより購入しました（材料についてはTable 3：使用した試薬を参照）。

サンプル前処理を自動化するため、必要なデバイスをインテグレーションしました（Figure 3）。遠心分離機（VSpin, Agilent Technologies, Santa Clara, US）をBiomek i7ハイブリッドワークステーションの左側に組み込みました。適切な遠心分離を担保するため、遠心分離機の近くに適切なバランス用プレートを配置しました。Biomekに沈殿用バイアルを24本設置できるよう、専用のアダプタを開発しました（Figure 4参照）。固相抽出ステップの自動化のため、Positive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）をBiomek i7ワークステーションの右側に組み込みました。デッキレイアウトは最大96サンプルまで同時処理できるよう最適化しました。メソッドはカラム洗浄にメタノール/水（60/40, v/v）を96 mL、タンパク質沈殿とカラムのコンディショニングには水またはメタノール48 ｍLなど、大量の溶媒を必要とするため、 Self-Refilling Quarter Reservoir（amplius GmbH, Rostock, DE）を自動充填装置として組み込みました。

Figure 3. ビタミンD検査用デッキレイアウト ー （1）チップボックス、（2）カウンターバランス、（3）遠心機、（4）アルミニウム製溶出バイアル瓶、（5）内部標準液、（6）タンパク質沈殿用バイアル、（7）サンプル、（8）Self-Refilling Quarter Reservoir、（9）SPEカートリッジアダプタ

Figure 4. （a）サンプルバイアルのストレージアダプタ（CELISCA, Rostock, DE）,（b） VSpin遠心機に沈殿用バイアルを24本設置するための専用アダプタ （CELISCA, Rostock, DE）、（c） Positive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）。

Table 1 にサンプル前処理プロトコルの詳細を示します。簡単にまとめると、血清サンプルを1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tubes（Eppendorf, Hamburg, DE）に入れ、タンパク質を沈殿させました。次に、血清サンプルに内部標準液を添加し、オンデッキで混合と遠心分離を行いました。固相抽出はStrata^® C8 cartridge（Phenomenex, Torrance, USA）を使用し、インテグレーションしたPositive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）で加圧処理しました。抽出後、サンプル10 μLを流速0.5 mL/分でLC/TOF-MS（Agilent Technologies, Santa Clara, US）に注入し、解析しました。システムは内部標準法に従い、25（OH）D₂および25（OH）D₃含有量0.01～ 2 ppmの範囲でキャリブレーションを実施しました。

Table 1. 加圧固相抽出によるビタミンD測定用サンプル処理プロトコル

Figure 5. Biomek i7ハイブリッド・ビタミンD測定前処理自動化メソッド‐統合した遠心分離機による除タンパク質の自動化

Figure 6. Biomek i7ハイブリッド・ビタミンD測定前処理自動化メソッド ー SPEによるサンプル洗浄の自動化

結果・考察

次のページのFigure 7（a）（b）は、25（OH）D2および25（OH）D3のキャリブレーション曲線です。自動化メソッドでの回収率は、25（OH）D2で77.12% ～ 90.01%、25（OH）D3で82.85～90.50 %となりました。再現性は10サンプルを測定したデータから計算しました。その結果、最大変動係数（CV）は、25（OH）D2で3.54%、25（OH）D3で2.52%となりました。ラボ内精度を、10サンプル5日間繰り返し測定を行い検証しました。その結果、CVは25（OH）D2で3.07% ～4.71%、25（OH）D3で1.63～3.06%となりました。

Figure 7. （a）25（OH）D₂と（b）25（OH）D₃のキャリブレーション曲線

検出限界（LOD）と定量限界（LOQ）については、25（OH）D₂でLOD＝1.15 ng/mL、LOQ＝2.46 ng/mL、25（OH）D₃で、LOD＝3.09 ng/mL、LOQ＝7.66 ng/mLでした。LC/MS/MSシステムを利用すると、検出限界をさらに改善することが可能です。得られた結果は、タンパク質沈殿を遠心分離で行う従来法と同等でした⁴ 。

まとめ

本アプリケーションノートでは、遠心分離と固相抽出によるビタミンD濃度測定法をBiomek i7ハイブリッドワークステーションで自動化しました。自動遠心分離機とPositive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）を組み込むことで、ワークフローを自動化しました。LC/MSと作成したキャリブレーション曲線を使って調製済サンプルを分析し、メソッドの再現性を確認しました。本自動化ワークフローで得られたCV値の低さ（2～9%）から、再現性の高さが示されました。得られた結果は、用手法によるサンプル前処理と同等のものでした。

参考文献

1. Kaptein S, Risselada AJ, Boerma EC, et al. Life-threatening complications of vitamin D intoxication due to over-the-counter supplements. Clinical Toxicology 2010; 48（5）: 460-462.
2. Christakos S, Ajibade DV, Dhawan P, et al. Vitamin D: Metabolism. Rheumatic Disease Clinics of North America, 2012; 38（1）: 1-11.
3. Vieth R, The pharmacology of vitamin D, including fortification strategies. Vitamin D, 2003; 2:995-1015.
4. https://www.gerstel.de/pdf/Aktuell-43-Vitaminanalytik_de.pdf

使用した機器・試薬・消耗品など

Table 2. 使用した機器

Table 3. 使用した試薬

Table 4. 使用した消耗品

Biomek i-Series自動化ワークステーションは、疾患等の診断での使用を意図しておらず、検証も行っておりません。

本プロトコルはデモンストレーションのみを目的としており、ベックマン・コールターによる検証は行っておりません。本プロトコルに関して、ベックマン・コールターは、明示または暗示を問わず、いかなる保証を行うものではありません。これには特定目的への適合性、または商品性、あるいはプロトコルの特許不権侵害の保証を含みますが、これに限定するものではなく、その他一切の保証を明示的に排除いたします。このメソッドの使用はお客様の責任のみにおいて行われるものとし、ベックマン・コールターは一切の責任を負いません。また、疾患等の診断での使用を意図しておらず、検証も行っておりません。

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