デジタルフローサイトメーター新技術 弱点の克服

現状の不満点・問題点

従来のアナログ方式のフローサイトメーターは、3カラー以上の蛍光補正が困難で、不正確な設定になってしまいます。
また、ノイズが多く、さらに対数データの直線性が低く、正確なネガティブピークを描くことができません。

アナログ方式（図1. 上）は、シグナルパルスの処理をすべて完了した後、最後にA/Dコンバーター（アナログデジタル変換器）で数値化し、コンピュータに送ります。一方、デジタル方式（図1. 下）は、プリアンプでシグナルパルスの調整をした後、すぐに数値化し、その高分解能なリニアデータを用いて、DSP（デジタルシグナルプロセッサー）で蛍光補正とLog（対数）変換などを、算術的に処理します。

図1. アナログ方式とデジタル方式　概念図

デジタル方式のメリットは、高分解能なリニアデータを用いて、高精度な対数データが取得でき、またフルマトリックス蛍光補正が行える点です。

デジタル方式は、さらに2つに分かれます。
(1) ピークホールド型（ハイブリッド型）
(2) 時間サンプリング型（フルデジタル型）

時間サンプリング型は、新しい技術で、秒1万個以上の高速測定に対応できます。回路設計を巧妙に行えば、
1秒間に5万個以上の超高速測定や超高速ソーティングが実現でき、さらにS/N比の向上も可能です。

デジタル方式には、広い測定範囲をカバーする高分解能のA/Dコンバーターが必須です。抗体を用いる免疫蛍光測定では、強陽性と陰性の蛍光の強度範囲が広く、通常は1：10,000の4桁の範囲の対数データで表示します（図2）。

図2. フローサイトメトリーの測定範囲

最大1万倍の差がある各シグナルパルスの高さ（面積）を、デジタル方式は直接、数値化し、その高分解能なリニアデータを基にLog（対数）変換する必要があります。従来の14ビットデジタル方式は、元になるリニアデータの分解能が低いため、対数データの目盛の小さな値の範囲（一桁目）での量子化誤差が大きな問題でした(図3)。

図3. 14ビットデジタル方式の量子化誤差

そのため、陰性ピークの位置が高い位置（10から100の間）に出るように感度調整をしなければならず、強陽性のピークが10,000を越えてスケールアウトすることがありました。実質的には、3桁の対数データでした(図4)。

図4. 14ビットデジタル方式の陰性ピーク位置

デジタル方式のA/Dコンバーターの分解能（ビット数）と対数（1から10,000）の測定分解能の関係を下表に示します（ピークパルスの場合）。

表1. デジタル方式のビット数と対数の分解能

アナログ方式の場合、アナログ回路でシグナルパルスをログ変換した後、10ビットA/Dコンバーター、すなわち1024チャンネル（レベル）で数値化します。つまり、対数1桁の範囲の測定分解能は、256チャンネル（レベル）です。
デジタル方式の場合、14ビットA/Dコンバーターならば、対数一桁目の測定分解能はわずか14チャンネル（レベル）しかありません(表1)。これでは、正確な陰性ピークを描くことができません(図3参照)。これは14ビットデジタルフローサイトメーターの弱点で、推量補間とスムージング、積分処理（時間サンプリング型）などで、陰性ピークを取り繕うことがあります。そのため、高感度のフローサイトメーターとヒストグラムデータが異なることがあります。下図のように感度・分解能に影響をおよぼします。

デジタル方式フローサイトメーター　分解能・感度の比較データ

アナログ方式と同等以上（256チャンネル以上）の測定分解能を得るためには、19ビット以上のA/Dコンバーターが必要です。しかしながら、現在、時間サンプリング型デジタル方式に使用可能なA/Dコンバーターは、最高16ビットです。

 Dual ADC技術

Dual ADC技術（弊社特許）を用いれば、20ビット以上の高分解能リニアデータを手に入れることができます。シグナルを2つに分け、増幅率の異なる2つのプリアンプを用いて、2つのA/Dコンバーターで同時に数値化します。2つの数値データを比較して、数学的に1つに合体させ、20ビット以上の高分解能リニアデータにします(図5)。
この独創的な技術により、正確な陰性ピークが得られます。また、20ビット以上あるので、高精度自動蛍光補正が行えます。Dual ADC技術はデジタルＮＲの効果も大幅に向上させ、蛍光感度や散乱光感度が向上します。さらに、22ビット以上あれば、1：100,000の5桁の対数範囲をカバーすることも可能です(図6)。アナログ方式では、5桁の対数データは不可能です。

図5. Dual ADC 23　概念図（23ビット）

図6. 5桁の対数データ

Dual ADC技術のメリット

1. 正確な陰性ピークが得られます。
2. 高精度自動蛍光補正が行えます。
3. 蛍光感度や散乱光感度が向上します。
4. 1：100,000の5桁の対数データが得られます。（22ビット以上）
5. 測定表示範囲の変更（ズーム機能）が測定後に行なえます。

Dual ADC技術は、弊社デジタルフローサイトメーターCytomics FC500には20ビットハイブリッドタイプ、Galliosには20ビットフルデジタルタイプ、セルソーター MoFlo XDPとセルソーター MoFlo Astriosには23ビットフルデジタルタイプが搭載されています。

参考データ