SARS-CoV2感染応答についての標準化ドライ抗体パネルを使用したフローサイトメトリーの有用性

Authors, R Bowers1 , Giulia Grazia2, Michael Kapinsky3, Vashti Lacaille4, Anis Larbi5
1Beckman Coulter, Indianapolis, IN, 2Beckman Coulter, Cassina de’ Pecchi, Italy, 3Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany, 4Beckman Coulter, Miami, FL, 5Beckman Coulter, Villepinte, France

緒言

SARS-CoV2感染における重症度の早期指標を特定するため、確立されている免疫細胞フェノタイプのポピュレーションについて、フローサイトメトリーを中心技術とした大規模研究を実施しました1-3。The ONE Study4-6によって示されているように、標準化された試薬パネルと手順を使用することは、世界的規模のパンデミックを対象とした大規模で複数機関にまたがる研究において、比較可能な一貫性のある結果を確保できる有望なアプローチであるとともに、技術的なハードルも低くすることができます。

 

目的

網羅的免疫プロファイリング用試薬セットとして高度に標準化されたドライ試薬DURAClone* 抗体パネル(ベックマン・コールター)に、液状の抗体試薬を追加して拡張し、その免疫プロファイリング研究ツールとしての有用性を健常者および SARS-CoV2陽性ドナーで評価しました。

 

方法

サンプル

下記ドナーから得た凍結保存PBMC

  • COVID 19陰性の健常ドナー(n=4)
  • COVID 19陽性で、無症状(n=2)、軽症(n=2)、中等症(n=1)、重症(n=2)

抗体パネル

パネル#1: DURAClone IM Phenotyping Basic*

Drop-ins HLA-DR-PacBlue, CD123-PC5.5

405 nm 488 nm 561 nm 638 nm 808 nm
HLA-DR-Pacific Blue CD45-Krome Orange CD16-FITC CD56-PE CD19-ECD CD123-PC5.5 CD14-PC7 CD4-APC CD7-A800 CD3-APC-A750 ViaKrome 808 FVD

 

パネル#2: DURAClone IM T cell subsets*

Drop-ins CD31-BV605, CD25-BV650, CD127-BV785

405 nm 488 nm 561 nm 638 nm 808 nm
CD57-Pacific Blue CD45-Krome Orange CD31-BV605 CD25-BV650 CD127-BV785 CD45RA-FITC CD197-PE CD28-ECD CD279-PC5.5 CD27-PC7 CD4-APC CD8-A700 CD3-APC-A750 ViaKrome 808 FVD

 

パネル#3: DURAClone IM B cells*

Drop-ins CD25-PC5.5, CD71-APC-A700

405 nm 488 nm 561 nm 638 nm 808 nm
IgM-Pacific Blue CD45-Krome Orange IgD-FITC CD21-PE CD19-ECD CD25-PC5.5 CD27-PC7 CD24-APC CD71-APC-A700 CD38-APC-A750 ViaKrome 808 FVD
 

ワークフロー

 

結果

DURAClone IM Phenotyping Basic* パネルにより、健常ドナーおよび COVID-19陽性ドナーのリンパ球および単球のサブポピュレーションに関する情報が得られました。

Figure 1

図1: A) 健常ドナーおよび重症度の異なる4名の COVID-19陽性ドナーから得たPBMCを DURACloneで染色して測定し、主要な細胞サブセットのマニュアルゲートポピュレーションをviSNE map (Cytobank*)上にオーバーレイ表示。B) 非古典的 (CD14-CD16+) 、古典的 (CD14+CD16-) 、intermediate (CD14+CD16+) 単球の相対的割合を、健常ドナーおよび無症状のドナーと、症状のある COVID-19陽性ドナー間で比較した。ポピュレーションを定義する9つのマーカーを使用しデフォルト設定でviSNEを実行した。

DURAClone IM T Cell Subsets* パネルで、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞、最終分化までを含めた T細胞成熟段階の描写が可能です。

Figure 2

図2: A) 健常ドナーおよび重症の COVID-19 陽性ドナーのFlowSOMメタクラスタをviSNEマップ (Cytobank*) 上にオーバーレイ表示。B) FlowSOM メタクラスタのマーカー発現をヒートマップで視覚化。データはコンペンセーション後、Kaluza解析ソフトウエアでLogicle変換され、 Kaluza* Cytobank Pluginで Cytobankプラットフォームにアップロードされます。ポピュレーションを定義する12のマーカーを使用しデフォルト設定で viSNEを実行した。FlowSOMはhierarchical consensus設定で実行した。C) サンバースト(Cytobank) を使って2つの典型的なサンプルにおけるマニュアルゲートの階層的構成を表示。

DURAClone IM B Cell* パネルで、 B細胞が成熟後期のどのステージ(移行期、アイソタイプクラススイッチ、ナイーブ期やメモリー期)にあるかを同定可能です。

DURAClone IM B Cell

図3:健常者および COVID19陽性ドナーから得たPBMCサンプルのB細胞サブポピュレーションを示す典型的なプロット  A) IgM/IgDによるクラススイッチ  B) CD27/IgDによるナイーブ/メモリー期  C) クラススイッチされなかったメモリーB細胞  D) クラススイッチされたメモリーB細胞および形質芽球

Figure 3

 

結論

  • DURAClone IM抗体パネルPhenotyping Basic、T Cell SubsetsおよびB Cell (すべてRUO*)を使用して、研究目的での標準化した免疫プロファイリングが可能で、抗体の追加も柔軟に行うことができました。
  • 本研究では、冷凍保存された健常者および SARS-CoV-2陽性サンプルで、マニュアルゲーティング解析および教師なし解析のどちらにおいても著しい相違を示しました(統計的有意差なし、少数n)。
  • DURAClone*ドライ抗体試薬はヒューマンエラーを低減させることから、一貫性に欠ける染色プロトコルにより得られた結果とは異なり、観察された相違は生物学的差異によるものであることが確保されます。

 

参考文献

  1. Cossarizza A et al. SARS-CoV-2, the Virus that Causes COVID-19: Cytometry and the New Challenge for Global Health. Cytometry A. 2020;97(4): 340-343.
  2. Schulte-Schrepping J et al. Severe COVID-19 Is Marked by a Dysregulated Myeloid Cell Compartment. Cell. 2020;182(6):1419-1440
  3. Mathew D et al. Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immunotypes with therapeutic implications. Science. 2020;369(6508)
  4. Streitz M et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant Res. 2013;2(1):17.
  5. Kverneland AH et al. Age and gender leucocytes variances and references values generated using the standardized ONE-Study protocol. Cytometry A. 2016;89(6):543-564.
  6. Sawitzki B et al. Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials. Lancet. 2020; 395(10237):1627-1639.

 

*研究用です。診断には使用できません。

 

 

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