虹彩細胞からの網膜細胞再生へ ～MoFlo Astriosの役割～

藤田保健衛生大学
研究支援推進センター 共同利用研究推進施設（再生医療支援推進施設）
分子生物学
准教授 山本 直樹 先生

研究者と機器管理者というふたつの立場からセルソーターに携わってこられた山本先生に、iPS細胞からの機能性網膜細胞再生の研究に使用する際のMoFlo Astriosと共同利用研究施設の機器管理者にとってのMoFlo Astriosそれぞれについてお話をお伺いしました。

網膜細胞再生の研究

研究のきっかけは自身の体験から

高校生のときに外傷で網膜剥離をおこし、網膜手術を経験しました。その際に「実際にものが見えなくなる怖さ」を身を持って体験し、また現在の眼科治療において視力（視細胞）の再生はまだ難しいことや多くの患者様が目の怪我や病気によって苦しまれている現状を知り、「新しい治療法を作れないか」という思いから眼の再生医療に対しての研究を始めました。

iPS細胞からの網膜細胞再生の研究
~虹彩細胞から神経細胞への分化~

眼の虹彩細胞は網膜の神経細胞の一番先端にある細胞から発生しています。つまり、虹彩細胞は基本的に網膜細胞と非常に近い細胞に分類されます。

虹彩細胞の研究は、イモリの研究で代表されるようにかなり前から行われています。水晶体を取ったイモリの目の中では、虹彩細胞から水晶体が再生します。このように、虹彩細胞は非常に分化転換の起こりやすい細胞であるという研究報告がされています。

ドラスティックに変化することができる虹彩細胞の神経細胞への分化とそのメカニズムを明らかにするために、まず虹彩細胞を培養することから研究を始めました。この虹彩細胞は培養するのが非常に難しい細胞で、培養する条件を見つけるのに2年ほどかかりました。現在では、大学の倫理委員会の承認を受け500名以上の患者様が手術の際に切除・破棄される虹彩の細胞を培養し、ストックしています。

神経の再生には神経系に分化する幹前駆細胞が必要となりますが、培養している虹彩細胞の全てが神経幹前駆細胞というわけではありません。虹彩細胞を培養するにあたり、まず細胞をセレクションしなければなりませんでした。神経細胞、もしくは神経幹/前駆細胞に発現するマーカーとして代表的なものがNestinとMusashiと言われています。しかし、両方とも細胞質に発現し細胞の膜表面には発現していないため、これらのマーカーを使って細胞を生きている状態で分取するのは難しいという問題がありました。そこで、NestinとMusashiを細胞質中に発現している細胞の膜表面に共発現しているマーカーはないかという研究を行いました。結果としてCD271（p75NTR）というマーカーが神経幹/前駆細胞の膜表面で共発現しているということが分かりました（特許取得）。このマーカーを用いることによって、初めてセルソーターを使って神経幹/前駆細胞を生きたままソーティングすることができるようになりました。そして、このソーティングした神経幹/前駆細胞に初期化遺伝子を導入することにより、患者様の細胞を用いて虹彩由来iPS細胞を樹立することができ、網膜再生へのプロジェクトが大きく前進しました。

虹彩から神経幹/前駆細胞を分取

手術の際に切除した虹彩組織から虹彩細胞を培養し、p75NTR（CD271）マーカーを使用してp75NTR陽性細胞をMoFlo Astriosでソーティング。ソーティング後、神経幹/前駆細胞マーカー（細胞内外）で免疫蛍光染色を行い、生理学的な機能性を有する神経細胞であることが確認された。（山本先生ご提供）

細胞へのダメージレスなMoFlo Astriosのサイトノズル

私たちが扱う細胞やiPS細胞、ステムセル、ES、ティッシュ・ステム・セル（tissue stem cell）などは、血球系の浮遊細胞とは異なり（細胞自体が）非常に弱い傾向にあります。さらに、細胞を酵素処理でディッシュから剥がす時に細胞へのダメージがあり、マーカーによっては発現が少し弱くなったり、消失してしまったりするような場合もあります。この様なダメージに弱い細胞をソーティングする際は、冷却機能を使用して細胞を冷やした状態で安定的に流すことがとても大事なポイントになります。

セルソーターで神経幹/前駆細胞を分取するために、まずMoFlo Astriosと他社のセルソーターを比較検討しました。他社セルソーターのノズル（キュベット型フローセル）は、フローセルノズルの構造上に段差が少しあります。その段差によって細胞が流路内で回ってしまい、また細胞が段差に衝突する事象も常に発生しました。その結果、他社セルソーターで分取した場合では、細胞の約60%だけが生きており、それ以外の細胞はダメージを受けてしまっていました。一方で（Jet-in-Air方式の）MoFlo Astriosは細胞に対するダメージが少なく、生きた状態の細胞が95%も分取でき、次の細胞アッセイを行うことができました。

MoFlo AstriosのCytoNozzle（a）は高速の液流においても乱流が生じないように設計されています。フローセル内面を平滑化処理（特許取得）し、細胞にストレスの無いように滑らかにストリームを絞り込むことで、細胞の生存率を高め、高速ソーティングを長時間安定化します。キュベット型のフローセル（b）は、キュベット内径とシース流出部の内径が異なるため、キュベット内と流出部との流速が異なります。（ベックマン・コールター）

機器管理者として

様々なアプリケーションを実施する共同利用研究施設において、セルソーターを選ぶ際の絶対条件は「液滴の安定性」と「レーザや検出器の拡張性」です。

安定したセルソーティング～ドロップディレー～

セルソーター機全般に言えることですが、目的の細胞を正確にソーティングする為には、液滴（ドロップ）が安定していつも同じ位置に存在しなくてはいけません。

幹細胞のようなダメージに弱い細胞をソーティングする場合には、ノズル口径の大きい100 µmノズルを使用していますが、他社の機器ではドロップ形成の設定後のドロップ位置の安定が悪く、ドロップディレーが安定するまでに時間が掛かってしまいます。それに比べ、MoFlo Astriosは100 µmノズルでもドロップ形成の設定後ほとんどドロップの位置は変化せず、ドロップディレーはすぐに安定します。MoFlo Astriosの「いつでも簡単にすぐにスタートアップしてソーティングが行えるところ」が気に入っています。

ドロップディレーとは

レーザヒットポイントを始点とし、ストリームが液滴に変わる点（ブレークオフポイント）までの距離（時間）を示します。目的の細胞の検出（レーザヒットポイント）から、目的の細胞が入った液滴にかけるタイミング（プレークオフポイント）までに時間差があります。このドロップディレーが変わってしまうと目的の細胞ドロップに正確に電荷が掛けられず、結果としてソーティングの不安定さに繋がります。MoFlo Astriosは絶えずCCDカメラで液滴を監視し、液滴の形状を自動補正（IntelliSort機能）することにより安定したソーティングを実施します。（ベックマン・コールター）

多彩なアプリケーションに対応 レーザの拡張性

本学で使用しているMoFlo Astriosには、青（488 nm）レーザ、赤（640 nm）レーザ、UV（355 nm）レーザを搭載しています。研究において色々なアプリケーションが拡がるなか、将来においてもMoFlo Astriosはバラエティー豊富なレーザを追加搭載（最大7本のレーザが搭載可能）でき、対応蛍光色素の拡張性があるので助かります。

使用可能な蛍光色素例

（ベックマン・コールター）

多彩なアプリケーションに対応 シングルセルソートのテクノロジー

セルソーターは、ソートストリームにチャージをかけストリームに角度をつけることにより細胞をチューブにソートします。この技術はセルソーターとして伝統的なものだと思います（※ MoFlo Astriosも、6種類の細胞を同時に大量にソーティングする場合は、この技術を使用しています）。しかし、96、384、1536ウェルプレートのような小さなポイントに向けてソートする場合、この旧来のソートストリームに角度をつけてソートする技術では、厳密にストリームをコントロールするのは難しいと思います。これに対し、MoFlo Astriosの特に素晴らしいところは、ソートストリームを垂直に落下させることができるということです。このソートストリームを垂直に落下させ、不要な細胞を含むアボートストリームを偏向してウエストキャッチャーに落とす技術は、96、384、1536ウェルプレートに正確に細胞をソートできます。細胞を含む液滴を真っすぐに落下させたほうが間違いなくウェルに落とせますので、そのテクノロジーは非常によく工夫し考えられたものだと思います。

MoFlo Astrios EQ/EQsは、全てのソートストリーム、ウエストストリームの角度を自由に変更できます。サイドストリームを直進（0度）に設定することが可能なので、平面に置かれたマイクロタイタープレートへも垂直に細胞を落下させることができます。垂直落下方式は、従来の偏向したストリームによるマイクロタイタープレートへのソーティング時に起こるウェル壁への細胞衝突のリスクを最小化し、より確実な細胞の回収と細胞へのストレスを最小化します。

ウエストキャッチャー

温度コントロール可能な各種サンプルフォルダー

（ベックマン・コールター）

安心のサポート体制

精密機器であるセルソーターを管理する立場としても、機器を使用するユーザーとしても、日常的にMoFlo Astriosの100%の性能を引き出せることを目指しています。その管理と使用の両面で、ベックマン・コールターのサービスエンジニアはしっかりとした知識と丁寧な説明で私たちをサポートしてくれています。また、本学では年間保守点検契約を結んでいますが、保守点検に入っているという安心感だけではなく、それに見合うだけの技術提供やパトロール点検等を実践していただけるなど、サポート体制が充実していて大変満足しています。

研究においてのMoFlo Astriosの役割

今の日本の大きな研究テーマとして「再生医療」と「がん」の研究が挙げられると思います。この「再生医療」と「がん」の研究は両極端に違うイメージがあるかもしれませんが、実はひとつの共通点を持っています。それはステムセルを取り扱うということです。「再生医療」の場合はいわゆる幹細胞といわれるステムセル、「がん」の研究の場合はキャンサー・ステム・セル（cancer stem cell）といわれているがん幹細胞です。

全ての研究課題において必要なのは細胞です。目的とする細胞を正確に分取するのは、やはりセルソーターではないとできないことのひとつです。研究の過程において、セルソーターの立ち位置は基本的に真ん中です。つまり、研究がスタートして、論文、学会発表というゴールがあったときに、最終的に解析しデータを出せるように、実験過程の中で非常に重要な細胞を濃縮もしくはセレクションしていくための重要なツールであるということです。セルソーターをきちんとコントロールした結果として、非常にいい研究成果、いい論文ができるのです。

今後の研究の中で、MoFlo Astriosの位置付けは、結果につながる重要な大黒柱のひとつだと私は思っています。

高校生までNHKジュニアオーケストラに所属し、市民団体のオーケストラ指揮や編曲も手掛ける山本直樹先生。藤田保健衛生大学病院での患者様の為の院内ボランティア演奏会に向け、練習されていらっしゃるとのことでした。

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