ベックマン・コールターの装置を使用してエクソソームの分離および特性評価を行うための標準化・自動化されたアプローチ

内容タイプ: Application Note
Chad Schwartz, Ph. D., Zach Smith, M.S. Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN 46268

Abstract & Introduction

エクソソームは、後期エンドソーム由来の微小胞であり、文献では120 nm未満と記述されることが最も多く、すべての細胞種から放出され、癌の転移に関与していることが示されている1-3。 エクソソームの生物学的機能はまだ完全には解明されていないが、エクソソームの特性評価および解析は研究分野として急速に発展している。エクソソームには、タンパク質や脂質のほか、さまざまな標的遺伝子に対する調節機能を持ったマイクロRNAが含まれている。最近の研究では、将来的にエクソソームが、癌だけでなく多くのヒト疾患において、臨床および診断上有用なバイオマーカーとなる可能性が示唆されている4。また、エクソソームが心血管疾患5-7、自己免疫疾患8、アルツハイマー病9やパーキンソン病10といった神経変性疾患、さらには結核11、ジフテリア12、HIV13などの感染症にも関連しているという興味深い知見も新たに得られている。

この興味深い研究分野を前進させるためには、エクソソームやその他の細胞外小胞(EV)を単離し、その特性を評価できる効率的で優れたプロトコルが不可欠であり、最近は専門家の間で標準化された方法を確立すべきとの声が上がっている。EVの単離は特に手間のかかる作業であり、小胞を高い純度で得るには、分画遠心法および密度勾配遠心法のステップを数回繰り返す必要がある。また下流においても、内包されているmiRNAの遺伝子プロファイリング方法が標準化されていないという課題がある。ここでは、Biomekを用いて、遠心用の密度勾配作製・分画化、total RNA抽出、および次世代シーケンシング(NGS)のためのcDNA増幅およびクリーンアップを行う自動化ワークフローについて記載する。また、良性およびがん性の大腸細胞株を用いて実施したNGS解析の結果を報告する。

Materials & Methods:

エクソソーム除去培地の調製:

超遠心処理FBS使用培地:標準的なHI-FBS 500 mLを、アダプタ付きUltra-Clear 94 mL遠心チューブ(ベックマン・コールター、パーツ番号:345777)6本に均等に分注した後、Type 45 Tiロータ(ベックマン・コールター)に設置し、Optima XPN超遠心機(ベックマン・コールター)を使用して120,000 × g、4℃で18時間遠心した。各チューブの上清を回収して50 mLずつ分注し、使用するまで-20℃で冷凍保存した。その後、この遠心除去処理済みFBS 50 mLを、MEMおよびRPMI 1640培地450 mLにそれぞれ添加した。最後に、10 mM HEPESおよび100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシンとなるよう、各試薬を培地に添加した。

細胞培養:

HCT 116細胞(大腸がん)(ATCC CCL-247)およびCCD 841 CoN細胞(正常結腸)(ATCC CRL-1790)の凍結ストック株を解凍して別々のバッファに懸濁した後、まず6ウェル培養プレート(Becton Dickinson)に播種した。コンフルエントに達した時点で、細胞をT-175フラスコ(Greiner)に移し、培養をスケールアップした。この後の操作について簡潔に説明すると、両細胞株をトリプシン処理後、適切なバッファに再懸濁し、SX4750Aロータを設置したベックマン・コールターのAllegra X-15 Rを使用して、750 × g、20℃で10分間遠心した。細胞を再び適切なバッファに懸濁した後、1 mLをバイアルに移してVi-Cellに直接セットし、収量および生存率を分析した。

分画遠心法によるエクソソームの単離:

前のステップで細胞をペレット化した後、0.45 μmのフィルターを使って培地をろ過し、2000 × g、4℃で20分間遠心した。次いで、この上清をSW 32 Tiロータを装着したOptima XPN超遠心機を使用して10,000 × gで30分間遠心し、細胞残渣を除去した。再度上清を回収し、0.22 μmのメンブレンを使ってろ過した後、SW 41 Tiロータを装着したOptima XPNを使用して、100,000 x gで90分間遠心した。今度は上清を吸引し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁することで回収し、このサンプルを粗エクソソームとした。このサンプルは、-20℃で長期間安定である。

密度勾配遠心による追加精製:

サンプルをさらに精製するため、図2に示した体積および密度の遠心密度勾配を作製した。迅速で一貫性があり、かつ再現性の高い方法で作製するために、ベックマン・コールターのBiomek 4000ラボオートメーション用ワークステーションを使用した。勾配の上に再懸濁した粗精製エクソソームサンプルを重層し、SW 41 TiロータおよびOptima XPNを用いて、100,000 × g、4℃で18時間遠心した。遠心分離ステップ後に行う勾配画分の分取には、再びBiomek 4000を利用した。合計13画分について、液面のトラッキング機能を利用して上側から1 mLを回収し、TLA 120.2ロータを装着したOptima Max-XP卓上遠心機を用いてペレット化した。得られたペレットを再びPBSに懸濁してサイズ分析を行い、さらに回収したエクソソームについて予想される密度・サイズに基づいて画分7-9を混合した。TLA 120.2ロータを使用してこのサンプルを再度ペレット化し、最終的に少量のPBSに再び懸濁した。

粒子の特性評価:

この高度に精製された画分について、ベックマン・コールターのDelsaMaxを用いて再度サイズ分析を行った。並進拡散係数Dおよび流体力学的直径Dhを、ベックマン・コールターのDelsaMax Proを使用した514.5 nmにおける散乱光の自己相関分析により測定した。自動希釈は行わず、カットオフ半径のピークを0.5 nmと150 nmの間に設定し、DLSによるデータ取得を5秒ごとに20回行った。DelsaMaxのソフトウェアパッケージからデータをエクスポートし、Originに入力してプロットを作成した。

RNA抽出:

QiagenのmiRNeasyキットを用いて、両細胞株の高純度エクソソームおよび粗エクソソームからtotal RNAを抽出した。抽出したRNAについては、Thermo ScientificのNanoDrop 8000で濃度を測定し、Agilent BioAnalyzer Pico Chipでサイズ測定を行った。

NGSライブラリの調製、シーケンシング、および解析:

各組の画分から得たエクソソームRNAについて、Quant-iT RiboGreen(Life Technologies)およびSpectraMax i3プレート蛍光光度計(Molecular Devices)を用いて定量を行った。各エクソソームRNAのサンプル約100 ngを、Illumina対応のsmall RNAライブラリに変換した。この際、NEBNext Small RNA Library Preparation Kit for Illumina(New England Biolabs)を使用し、Biomek 4000リキッドハンドラー(ベックマン・コールター)上で自動処理を行った。サイズセレクションは、SPRIをベースとした方法で実施した。ライブラリ構築後、DNA High Sensitivity Chipを使用し、BioAnalyzer 2100 (Agilent)でライブラリの解析を行った。その後このライブラリについて、IlluminaのMiSeqを使用し、シングルリード法で50サイクルのシーケンシングを行った。シーケンシング終了後、IlluminaのBaseSpace Small RNAアプリケーションを使用してデータを解析した。

Results & Discussion

エクソソームは細胞外小胞の中でも最小のサブセットであり、テトラスパニン、細胞特異的受容体、脂質ラフト、タンパク質、およびsmall RNAから構成されている(図1)。またエクソソームは、細胞間のコミュニケーションに関与しており、その脂質由来の殻構造の中に封入されたメッセージが恒常性維持に重要な役割を果たしている。近年では、病的状態にある細胞へのナノデリバリーデバイスとして、エクソソームの治療効果が研究されている。

Figure 1. Schematic of an exosome budding from a cell and magnified to show major components.
図1.細胞から出芽するエクソソームの模式図。主要な構成要素を拡大して示している。

エクソソームは、ほぼあらゆる体液、細胞種、および動物種において認められるものであるが、細胞外小胞の研究において一般的に行われているのは、細胞培養を行うアプローチである。ここでは、ベックマン・コールターの生死細胞オートアナライザーVi-Cellを使用して、HCT 116およびCCD 841 CoN細胞の数および生存率を評価した。HCT 116およびCCD 841 CoN細胞の密度は、それぞれ1.52×108および0.82×108であった。生存率も高く、それぞれ97.3%および98.4%であった(表1)。

細胞株 細胞の由来 細胞の由来 生存率
HCT 116 大腸がん 1.52 x 108 97.3%
CCD 841 CoN 正常結腸 0.82 x 108 98.4%
表1:2種類の細胞株の細胞数および生存率

 

細胞全体や細胞残渣、大型の凝集塊、可溶性タンパク質を目的の小胞から分離するには、数ステップの分画遠心に加えて、密度勾配遠心を行う必要がある。これらのステップの詳細を図2に示した。実験方法は、大きく2段階に分けられる。第1段階は、4回目の遠心(100,000 x gによるペレット化)でエクソソームの単離が終了するまで、そして第2段階は、密度勾配分離を実施し、さらに2回のペレット化ステップが終了するまでである。遠心ステップに使用した初期の細胞数は、両細胞種間で等しくなるように揃えた。密度勾配遠心のワークフローでは、分離用溶液の重層および画分の分取にBiomek 4000ワークステーションを利用することで、ラン間のばらつきを抑え、実験のハンズオン時間を削減した。

 

Figure 2. Typical centrifugation workflow and iodixanol gradient setup for stringent purification of exosomes from cell culture. Gradients were layered and fractionated using a Biomek 4000.
図2.培養細胞からエクソソームを高純度で精製するための一般的な遠心分離ワークフローおよびイオジキサノール勾配の濃度設定。濃度勾配作製、および画分の分取には、Biomek 4000を使用した。

単離後、ベックマン・コールターのDelsaMax Coreを使用し、動的光散乱法によってエクソソームのサイズを測定した。全操作において、精製されたエクソソームは30〜150 nmの適切なサイズであったが、5 nm前後のタンパク質や他の粒子も残留していた。HCT 116細胞の粗エクソソームから得られたデータを、図3に示している。

Figure 3. Representative plot of DLS data acquired from purified exosomes.
図3.精製したエクソソームから得られたDLSデータの代表的なプロット。

その後、total RNAを抽出し、定量およびサイズの測定を行った。BioAnalyzerによる分析結果から、エクソソームにさまざまなサイズのRNAが含まれていることが明らかになった(図4)。このRNAは、20~30ヌクレオチドを中心とした幅の広いピークを持っており、miRNAの割合が大きいことが示唆されたが、それとともにmRNA、リボソームRNA、RNA前駆体といったRNA分子種についてもPico RNAチップでプローブされ、ピークとして検出された。驚くべきことに、粗エクソソームから得られたRNAと密度勾配精製エクソソームから得られたRNAは非常にサイズが似ていたが、RNA濃度に関しては、密度勾配精製で得られたものの方が顕著に高かった。

Figure 4. Electrophoretic BioAnalyzer trace of exosomal total RNA derived from CCD 841 CoN (top) and HCT 116 (bottom) cells isolated with (red) or without (blue) a density gradient.
図4.BioAnalyzerによるエクソソーム由来total RNAの電気泳動分析。CCD 841 CoN細胞(上)およびHCT 116細胞(下)について、密度勾配遠心前(赤)または後(青)のエクソソームの分析結果を示している。

各エクソソームサンプルから単離したRNAを用いて、Illumina対応のシーケンシング用Small RNAライブラリを作製した。この際、NEBNext Small RNA Library Preparation Kit for Illuminaを使用し、Biomek 4000のゲノミクス用ワークステーション上で処理を行った。ライブラリの定量には、Kapa Biosystems Illumina Library Quantificationキットを使用した。両細胞株(HCTおよびCCD)由来の粗エクソソーム(超遠心分離のみ)および密度勾配遠心精製エクソソームから抽出したRNAから、次世代シーケンシング(NGS)用のsmall RNAライブラリを作製し、50サイクル用v2シーケンシングキットを用いて、IlluminaのMiSeqでシーケンシングを行った。

FASTQの生成およびリードのトリミングを行った後、BaseSpace上でSmall RNAを用いてシーケンス解析を行った。このアプリケーションでは、hg19ヒトリファレンスゲノムへのアライメントにBowTieを、発現差異解析にはmiRDeepやDESeq2を採用している。密度勾配精製エクソソーム由来のRNAについては、PassFilterしたリードカウントが、CCD 841 CoNおよびHCT 116細胞において、それぞれ678,231および600,307得られたのに対し、粗エクソソーム由来のRNAでは、CCD 841 CoNおよびHCT 116細胞のリードカウントは、それぞれ660,025および617,001であった。リード数が多く、データセット間のばらつきが少ないことから、RNAの単離は安定して行われており、シーケンシング解析に十分な収量を得られていることが示唆される。

RNAのタイプには、細胞株および調製方法によって大きな差があった(図5)。一番上のグラフを見ると、miRNAの存在比は、HCT116細胞に対して密度勾配遠心を実施したサンプルにおいて最も低いが、成熟したmiRNAの比率はこのサンプルにおいて最も高くなっている(3番目のグラフ)。調製法間で最もばらつきが大きかったのは、HCT 116細胞であった。small RNAに関しては、密度勾配遠心サンプルではエクソンの存在比が非常に高かった一方、粗エクソソームサンプル中には逆にGtRNA、長鎖非コードRNA(lincRNA)、piRNA、RNA前駆体、snoRNA、およびsnRNAが多かった。存在量の多いRNAのうち、すべての細胞株および調製法において最も量が多かったのは、ヒトリボソームRNAであった。

 

Figure 5. Relative abundance chart of RNA type following FASTQ generation and read-trimming.
図5.FASTQ生成およびリードのトリミング後に集計した各RNAタイプの相対的な存在比。

また、シーケンシング解析をもとに、前駆体および成熟したmiRNAの発現ヒートマップを作成した(図6)。この図から、同じ細胞株であっても調製法によって発現に差があることが分かる。さらに詳細に解析を行うと、がん細胞株と正常結腸細胞株の間で発現量に大きな差のあるmiRNAファミリーが多く存在していることが明らかになった(図7)。15の遺伝子ファミリーにおいて、発現量に有意差が認められた。注目すべきはmir-1246、mir-182、およびmir-183であり、これらはすべて大腸がん由来のCCD 841 CoN細胞において、有意に発現上昇していた(>3.75倍の変化)。これら3つの遺伝子ファミリーは、実際に大腸癌において発現上昇することが過去に示されており14-16、我々が得た結果はこの事実とよく合致する。

Figure 6. Differential expression heat-map of preparation method within a single cell line. Both precursor miRNAs and mature miRNAs are plotted.
図6.各細胞株について調製法による差異を示した発現ヒートマップ。miRNA前駆体および成熟したmiRNAについて示した。

 

Figure 7. Differential expression of miRNA read counts within a sequencing library between HCT116 and CCD 841 CoN cells.
図7.HCT116およびCCD 841 CoN細胞のシーケンシング用ライブラリにおけるmiRNAリードカウントをもとにした発現差異解析。

 

Conclusions:

エクソソームに関連した新しい研究分野は非常に興味深いが、これを発展させるには、分離および特性評価法を標準化することが欠かせない。密度勾配超遠心法は、エクソソームの単離法として好んで使われることが多く、純度の高いサンプルを得ることができるが、そのワークフローは、研究室やユーザー間での再現性に欠けることもしばしばである。次世代small RNAシーケンシングは、エクソソームの特性評価やバイオマーカー同定の際に行う多くの下流アッセイの1つであるが、採用されるプロトコルは往々にして大きく異なっている。ここでは、ベックマン・コールターの装置を幅広く利用し、スループット、ウォークアウェイ時間、再現性、および結果の精度を向上させるソリューションを提示した(図8)。その結果、MiSeqによるシーケンシングを1度実施しただけではあるが、大きなインパクトのある次世代シーケンシングデータを得ることのできるワークフローであることが実証された。この方法は、候補となるバイオマーカーの特定や、サンプルタイプごとの発現の違いを測定する際に利用できるだろう。

 

Figure 8. Beckman Coulter’s standardized exosome workflow.
図8.ベックマン・コールターが標準化したエクソソーム実験のワークフロー。

 

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