導入

フローサイトメトリー実験ではしばしば、集団間、あるいは異なるタイムポイントや刺激条件のサンプル間で発現パターンを比較することが求められます。Overlayプロットは、1つのプロットに複数のヒストグラム、ドットまたは密度プロットを含み、パターンの比較が可能です（図1）。

図1. 全血サンプルからのオーバーレイの例。製造元の指示に従ってDURActive 3（製品番号 C21857）を用い、刺激がある場合とない場合の全血サンプルによるオーバーレイの例。サンプルは、取扱説明書にしたがって、DURAClone IF Monocyte Activation Antibody Panel（製品番号 C21858）で染色し、データはフローサイトメーターCytoFLEXで取得しました。A) CD14+細胞でゲーティングされたコントロールサンプルと、顆粒球（Gra）ゲートおよびCD14+細胞でゲーティングされた刺激サンプルからの、ドットプロットのオーバーレイを示します。B) 非刺激コントロールとDURActive 3刺激サンプルのヒストグラムオーバーレイ。プロットは例示のためのイメージです。

Kaluza AnalysisにおいてOverlayプロットは、個々のデータセット、マージされたデータセット、およびCompositeデータセットのデータ比較ツールとして使用できます。Overlayプロットでは、最大12個のプロットを比較することができ、オフセットや角度オプションなど、様々なヒストグラム表示が利用できます（図2を参照）。

図2. オフセットヒストグラムのオーバーレイ。 5つの全血サンプルを刺激の濃度を増やして処理し、製造元の指示に従ってDURAClone IF Basophil Activation Antibody Panel（製品番号 C23406）を用いて染色し、フローサイトメーターCytoFLEXで取得したオフセットヒストグラムのオーバーレイ。プロットは例示のためのイメージです。

1つのデータセット内での集団の比較

ファイルを読み込み、プロットやゲートを含む解析を作成するための詳しい手順については、Kaluza Analysis Flow Cytometry Software IFU C10986を参照してください。

• 解析対象のデータファイルを読み込み、比較対象の集団を同定します。
  
  

図3. Hierarchicalゲーティング。CD4+（水色）およびCD8+（ピンク）T細胞サブセットを同定するためのHierarchicalゲーティング。PBMC（末梢血単核細胞）は、カスタム乾燥試薬パネルを使用して染色し、データはフローサイトメーターCytoFLEX LXで取得しました。プロットは例示のためのイメージです。

• Overlayプロットを設定するには、Plots & TablesリボンタブのOverlayアイコンのドロップダウン矢印を選択し、目的のタイプ（Histogram、Dot、またはDensity）を選択します。次のセクションでは、Histogram Overlayを例として示します。

• Overlayプロットの横にある<Add Layer>ハイパーリンクを使って、Input Gate（入力ゲート）、Parameter（パラメータ）、Scale（スケール）、Color（色）を選択するか、Deleteを選択してプロットを削除することができます。

• ラジアルメニューを使用してプロットのカスタマイズを続けます。この例では、データのスケーリングをLogicleに切り替えました。Logicleスケールを使用すると、負の値が正しく表示され、正しく補正されたデータの望ましい対称的な外観が維持され、マルチカラーデータを表示する場合に有益な場合があります。y Parameterが% Gatedに変更されました。% Gatedオプションを使用すると、イベントの数が異なる集団の比較が容易になります。また、% Maxオプションを使用すると、Histogramsを標準化できます。% Gatedを使用すると、データセット間の数値的な差異をより正確に表現できますが、% Max＿を使用すると、すべてのデータセットの最大値を同じ水準にする視覚化が可能です。データを平準化すると、より快適な外観になるかもしれません。

• Displayメニューを使用して、Overlayプロットの外観の指定を行います。Histogram Typeを選択します。以下の表示オプションがあります。
  
  • Overlay: コンポジットギャラリー表示。
  • Offset: スケールに基づいて、各HistogramsまたはプロットをOverlay上でずらして表示します。すべてのHistogramsを、図表いっぱいに垂直にずらした位置に配置し、重ならないようにスケーリングします。
  • HalfOffset : 背の高いHistogramsが重なりうるように、垂直に半分ずらします。
  • Angle: 角度をつけたプロット(ピボットポイントを使用して角度を調整します)

成功のためのヒント:
個々のプロットが全て、同じスケールを使用している場合、軸の目盛りが表示されます。

異なるデータセットからの集団の比較

成功のためのヒント:

• 異なるデータセットから1つのOverlayプロットに集団を追加するには、比較するすべてのデータセットを含むCompositeを作成する必要があります。Compositeの詳しい作成方法については、Kaluza Analysis Flow Cytometry Software IFU C10986を参照してください。
• ゲーティング戦略を何度も作り直す必要がないようにするため、可能なワークフローの1つとして、ゲーティング戦略を作成し、Compositeを作成する前にすべてのデータセットにコピーすることが考えられます。
• 解析するデータファイルを読み込み、比較する集団を同定するゲーティング戦略を作成します。すべてのデータセットにプロトコルを適用するには、ドラッグ＆ドロップまたはコピー＋Paste Special（形式を選択して貼り付け）を使用します。詳細な手順については、Kaluza Analysis Flow Cytometry Software IFU C10986を参照してください。
• 解析するすべてのデータセットを選択し、Compositeを作成します。
• Overlayプロットを設定するには、Plots & TablesリボンタブからOverlayアイコンのドロップダウン矢印を選択し、必要なタイプ（Histograms、Dot、またはDensity）を選択します。
• 「1つのデータセット内での集団の比較」の項目で説明したように、プロットのカスタマイズを続けます。
  
  
  

異なるデータセットまたは1つのデータセット内の既存のプロットの比較

• Altキーを押しながら既存のプロットをドラッグして、そのパラメータをOverlayプロットに追加します。

注: Altキーを押す前に複数のプロットが選択されている場合、複数のプロットを同時にOverlayプロットにドラッグすることができます。

使用例：viSNEマップのオーバーレイ作成

tSNEパラメータを含むデータセットがある場合、例えば、Cytobankプラットフォーム上でviSNE解析を実行し、fcsファイルをダウンロードした後でKaluzaを使用し、ファイルをマージすることなく、異なるサンプルからのデータを含む包括的なviSNEマップを作成することができます。

• tSNEパラメータを含むファイルを読み込みます。
• 解析するサンプルを含むCompositeを作成します。
• tSNE1とtSNE2をそれぞれx Parameterとy Parameterとして、すべてのデータセットのドットプロットを作成します。logicleスケーリングを選択し、スライダーを軸の最大値に移動して、0以上および0以下の線形スケーリングでviSNEマップを視覚化します。
• ドットプロットのOverlayプロットを作成し、Overlayに追加するドットプロットを複数選択し、Altキーを押しながらドットプロットをOverlayプロットにドラッグ＆ドロップします。
  
  
  このドキュメントは、取扱説明書に代わるものではありません。
  * 研究用としてのみ使用してください。診断手順には使用しないでください。