Kaluza入門：パラメータ

ここでは、Kaluza解析ソフトウェア*を用いてパラメータ名と説明文の変更方法、パラメータの読み込みとアンロードの方法、変更内容を他のデータセットに転送する方法をご紹介します。パラメータ名を編集することで、様々な機器構成で取得したデータセットにKaluza Analysis Protocolsを転送できるようにする方法や、Kaluza Cytobankプラグインを使用してデータセットからパラメータを削除する方法などの例をご紹介します。

フローサイトメトリーのパラメータ名

サイトメトリーにおいてパラメータとは、光散乱、蛍光、面積、高さ、および幅についての測定値を含むフローサイトメーター検出器から収集されたデータのことです。取得したパラメータに関する情報は、FCS3.0またはFCS3.1標準に準拠したファイルのTEXTセグメントに格納されます(Spidlen et al., 2009)。 FCSキーワード$PnNは、パラメータnのショートネームを格納するために使用されます。Kaluzaはこの情報をParameter Nameとして表示します。与えられたパラメータのショートネームは、サイトメーターによって取得されたパラメータのシーケンス（例えば、FCS3.0標準（Seamer et al., n.d.）に準拠したCytoFLEXプラットフォーム上のFLn）に由来するか、または、ここで一般的に検出される蛍光色素の名前を反映しています。 FCS キーワード $PnS は、与えられたパラメータ n に用いられる名前を格納するために使用されます。Kaluzaは、$PnSの値をParameter Descriptionとして表示します。CytoFLEXで取得したデータの場合、与えられたチャンネルに割り当てられたラベルも、その検出器構成においてこのチャンネルに使用された蛍光も、$PnSキーワード値として保存されます。Parameter NamesとParameter Descriptionsの編集方法や、関連機能の詳細については、Kaluza Analysis Flow Cytometry Software IFU C10986を参照してください。このドキュメントは取扱説明書に代わるものではありません。このテクニカルノートのデータは、DuraClone T cell subsets tube * (PN: B53328)で染色し、フローサイトメーターCytoFLEX LX * (PN: C40324)または V5-B5-R3 CytoFLEX* (PN: B53000)で取得され、Kaluza Analysis Software*で解析された正常な全血サンプルまたは PBMC サンプルを使用して作成されました。プロットは例示のためのイメージです。

図1. CytoFLEX LX 装置で取得したデータのParameter Names（$PnN）とParameter Description（$PnS）を示す KaluzaのParametersペイン。情報プロットは、DescriptionとFCSキーワード、そして、サイトメータータイプ、パラメータ4のショートネーム、パラメータ4に使用した名前の値を例示しています。

基本的なパラメータデータの編集

Parameter NameやParameter Descriptionといった基本的なパラメータデータを更新します。:

変更したいフィールドのテキストをハイライト表示します。

キーボードのDeleteキーを押します。

フィールドに新しい内容を入力し、Enterキーを押します。

成功のためのヒント

パラメータがParametersペインから更新されると、Protocolにおけるそのパラメータへのすべての参照も更新されます。

ここで説明する手順では、Kaluza Analysisで保存されたファイルのFCSキーワード$PnN（Name）と$PnS（Description）を変更します。生データファイルのキーワードは変更されません。Kaluza Cyotbankプラグインを使用して、$PnN（Name）と$PnS（Description）について更新された値を示す新しいFCSファイルをエクスポートすることができます。

以下の制限があります
- パラメータ名は5,000文字以内です。
- パラメータの説明は5,000文字以内です。
- パラメータ検出器は5,000文字以内です。

Edit Loaded Parameters（読み込んだパラメータの編集）

Kaluzaは最大64個のパラメータを読み込むことができます。それ以上のパラメータを含むファイルを開くことはできますが、余分なパラメータは無効化され、解析に使用することはできません。Data SetからKaluza Analysisに読み込んだパラメータを編集して、解析に使用する特定のパラメータを選択することができます。利用可能なパラメータの編集は、Edit loaded parameters（読み込んだパラメータの編集）ウィンドウで行います。

Kaluza Edit loaded parameters window

図2. Edit loaded parametersウインドウ

ParametersペインでEdit Loaded Parametersアイコンを選択し、Edit loaded parameters設定ウィンドウを開きます。

必要な項目を入力するか、目的のボタンやチェックボックスをクリックして、必要な設定を行います。

すべての変更が完了したら、OKをクリックします。これで、Parametersペインにリストされたパラメータ（およびProtocolで利用可能なパラメータ）に変更が反映されます。

パラメータを他のデータセットにコピー

この機能を使うと、パラメータの詳細（Name、Description、および対応するメタデータ）を他のデータセットにコピーすることができます。

パラメータデータをコピーするAnalysis Listエントリを右クリックし、Copyを選択します。

Analysis List上で、更新されたパラメータを受け取るデータセットを選択します。

選択した行のいずれかを右クリックして、Paste Special（形式を選択して貼り付け）> Parametersを選択します。

更新されたAnalysis Listの行を確認し、パラメータが更新されたことを確かめます。

図3. Paste special（形式を選択して貼り付け）> Parameters機能を使用して、パラメータを他のデータセットにコピーします。

成功するためのヒント

Paste special（形式を選択して貼り付け）機能を使用してパラメータ情報をコピーしても、読み込んだパラメータの選択は適用されません。Batch Processing（バッチ処理）機能を使用して、多数のデータセットに同じパラメータを読み込むことができます。Batch Processingの詳しい使い方については、Kaluza Analysis Flow Cytometry Software IFU C10986を参照してください。

処理するデータセットを読み込みます。

最初のデータセットで、必要なパラメータを読み込み、必要に応じてParameters NamesとParameters Descriptionsを編集します。

Cascade parameters values from previous analysis（前の解析からのパラメータ値を引き継ぐ）チェックボックスが選択されていることを確認します。

Save batched files as .analysis files（バッチしたファイルを.analysis fileで保存する）チェックボックスが選択されていることを確認します。

Process allを選択すると、さらにレビューすることなくすべてのファイルが自動的に処理され、Nextを選択すると、ファイルごとに手動で処理を進めます。ファイルを出力するフォルダを指定するため、Kaluza AnalysisがBrowse for Folderウィンドウを表示して指示を出します。

使用例: 基本的なパラメータデータを編集して、異なる機器構成にプロトコルを適用する

複数のファイルを同じKaluza Analysisプロトコルを使用して解析したり、Cytobankプラットフォーム上の一つのパネル内で解析したりするためには、一緒に解析するすべてのファイルが同じチャンネルと試薬名のコレクションを持っている必要があります。この条件が満たされていない場合、パネル/チャンネルの競合が発生します。同じパネルで取得したサンプル間で競合が発生することがありますが、Parameter Names ($PnN)またはParameter Description ($PnS)の間に競合が存在します。以下の例では、21 Detectors, 6 Laser CytoFLEX LX unitで取得したデータセットで開発したKaluza Analysisプロトコルを、V5-B4-R3 13 Detectors, 3 Laser CytoFLEX unitで取得したデータセットに適用するため、KaluzaのParameter Names（$PnN）を編集する方法を示しています。

The example below shows how to edit Parameter Names ($PnN) in Kaluza in order to apply a Kaluza Analysis Protocol developed on a data set acquired on a 21 Detectors, 6 Laser CytoFLEX LX unit to a data set acquired on a V5-B4-R3 13 Detectors, 3 Laser CytoFLEX unit.

how to edit Parameter Names ($PnN) in Kaluza in order to apply a Kaluza Analysis Protocol

Kaluza List of Parameters CytoFLEX LX

図4. NamesとDescriptionsが示されたParametersの一覧と、 CytoFLEX LXデータ上で確立された解析プロトコル。

Kaluza parameters

図5. プロトコルで使用されている3つのパラメータがデータセットで利用できません。利用できないパラメータは赤でマークされています。

異なる構成の機器で同じパネルを取得する場合、特定のマーカーに割り当てられたParameter Names（$PnN）が取得に使用された装置によって異なる場合があります。あるデータセット（例：CytoFLEX LX）からParameter Nameの不一致がある別のデータセット（例：V5-B5-R3 CytoFLEX）にKaluzaプロトコルを適用すると、エラーメッセージが表示され、プロトコルで使用されているパラメータが２つ目のデータセットには存在しないことを示します（図 5）。
Parameter Nameの不一致を防ぐには、Kaluza Analysisプロトコルを確立するために使用した元のデータセットのParameter Nameを、2台目の装置からのデータセットのParameter Nameと一致するように更新してください。

解析に使用しないすべてのパラメータをアンロードします。

Parameter Namesをプロトコルが適用されるデータセットに合わせて変更します。

2つ目のデータセットにプロトコルを適用します。

Kaluza Parameter Names

図6.手動で調整するA)前とB)後のParameter Names。

ゲーティング戦略で使用されるパラメータのParameter Namesがデータセット間ですべて一致する場合、Analysis Listにドラッグ＆ドロップすることでKaluza Analysisプロトコルを適用できます。ゲイン（または電圧）が機器間で標準化されている場合、必要なのはわずかなゲート調整のみです。ゲイン（または電圧）が標準化されていない場合、またはデータが異なるファミリーからの計器で取得された場合、異なるパラメータのスケールに調整する必要があるかもしれません。

Kaluza Analysis Protocol established on CytoFLEX LX data

図7. CytoFLEX LXのデータで確立されたKaluza AnalysisプロトコルをV5-B5-R3 CytoFLEXで取得したデータに適用した。

Kaluza Analysis Protocol established on CytoFLEX LX data

図8. CytoFLEX LXのデータに確立されたKaluza Analysisプロトコルを、スケールとゲートの調整後、3L 13C CytoFLEXで取得したデータに適用しました。

成功へのヒント

CytoFLEXファミリーに属する装置は、高さと面積の情報を、取得したすべてのパラメータの個別パラメータとして保存します。蛍光チャンネルの面積のみ、または高さのみの解析が必要な場合は、不要なチャンネルをアンロードすることで、Parameter listをより管理しやすくすることができます。

使用例 Kaluza Cytobankプラグインを使用したパラメータの削除

Cytobankプラグインは、KaluzaのFCSファイルをCytobankのクラウドベースのプラットフォームにアップロードして、さらなる解析を行うための機能をKaluzaに追加します。Cytobankプラグインを使用すると、Kaluzaユーザーは新しいFCSファイルを作成したり、パラメータ名やFCSキーワードの編集を適用したり、Kaluzaで生成されたコンペンセーションやlogicle変換を適用したりすることができます。加えて、Kaluza Cytobankプラグインを使用して新しいFCSファイルをエクスポートする前に、KaluzaのMerge機能を使用することで、最大48のデータセットからのデータを連結することができます。

Cytobankプラットフォーム上で同じパネル内のデータを解析するには、すべてのファイルでチャンネル数が一貫している必要があります。異なるチャンネル数のファイルを使用していて、最終的に同じパネル内のファイルをCytobankプラットフォーム上で使用したい場合、KaluzaとKaluza Cytobankプラグインを使用して、ユーザー定義のチャンネル数のみを含む新しい派生FCSファイルを生成することができます。Cytobankプラットフォームにアップロードされるパラメータは、Kaluzaにおけるパラメータの読み込みとアンロードによって選択されます。

Kaluza Cytobankプラグインの詳しい使い方についてはKaluza Cytobank Plugin for Kaluza Analysis Flow Cytometry Software Instructions for Use PN C56576を参照してください。Kaluza Cytobankプラグインは、Kaluza Analysis Software Downloadsのページからダウンロードできます https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads。プラグインを使用するには、アクティブなCytobank PremiumまたはEnterpriseアカウントが必要です。

元のパラメータのサブセットのみを含む新しいFCSファイルをエクスポートするには、以下の手順に従います。

Kaluza Analysisでデータセットを読み込みます。

Edit loaded parameters（読み込んだパラメータの編集）ウィンドウを使用して、新しいFCSファイルに含めたいパラメータのみを読み込みます。

Kaluza Cytobankプラグインを開きます。

Kaluza CytobankプラグインからCytobankアカウントにログインします。

コンペンセーション、データ変換、またはFCSキーワードを更新するための調整を行います。

「Next」を選択して、FCS ファイルを保存する場所を選択します。

FCSファイルを保存する場所を選択します。このステップでは、新しく生成されたFCSファイルをローカルに保存したり、1回のアップロードで複数のファイルを手動でCytobankプラットフォームに追加したりすることができます。保存場所を定義し、「Save」を選択します。

Cytobankプラットフォーム上で、新しく生成されたFCSファイルを追加する既存の実験を選択するか、新しい実験を作成します。

Uploadを選択し、Cytobankプラットフォームにデータをアップロードします。プロンプトが表示されたら、アップロードリクエストを確認します。

Generate FCS file window in Kaluza Cytobank Plugin workflow

図9 Kaluza CytobankプラグインのワークフローにおけるGenerate FCS file（FCSファイルの生成）ウィンドウ。