サンプル間のフローサイトメトリーデータの比較

異なるタイムポイントや細胞培養条件など、異なるサンプルの結果を比較することで、有意義な洞察が得られることがしばしばあります。ヒストグラムやドットプロットのオーバーレイは、この種のデータの可視化に役立ち（図1）、ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能です。

図1. T細胞サイトカイン発現の比較。非刺激（コントロール、青）および刺激（赤）CD4+ T細胞の比較。正常な全血サンプルをDURActiv 1 * (製品番号 C11101))を用いて活性化し、製造業者の指示に従ってDURAClone IF T Helper Cell Tube * (製品番号C04666)で染色しました。AおよびBは、それぞれIFN-γおよびIL-4発現のヒストグラムオーバーレイを示します。図Cは、両方のサイトカインのドットプロットオーバーレイを示します。プロットは例示のためのイメージです。

しかし、高度な統計解析をしたり細胞頻度やマーカーの発現量を比較したりするためには、統計結果のエクスポートや、表計算プログラムや統計ソフトでのデータ解析が必要となることが多いです。Comparisonプロットを使用すると、データセットや集団間で、ある特定の統計量を比較することができるため、フローサイトメトリーデータの解析に使用するソフトウェアで直接、折れ線グラフや棒グラフを可視化するにより、ワークフローを合理化することができます（図2）。

図2. コントロールサンプルおよび刺激サンプルにおける、CD4+ T細胞を発現するIL-4およびIFNγの比較プロットの棒グラフの可視化。 正常な全血サンプルをDURActiv 1 * (製品番号C11101)を用いて活性化し、製造業者の指示に従って、DURAClone IF T Helper Cell Tube * (製品番号C04666)で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

T細胞TCR Vベータレパトアのフローサイトメトリー測定

TCRレパトアの解析は、免疫システムをより理解するために非常に価値があります。フローサイトメトリーは、セルソーティングの必要はなく、複数のT細胞サブセットにおける比例したTCR-Vβの使用量を細胞ごとに迅速に測定します。１ IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit (IM3497)は、ヒトの正常なTCR Vβレパトアの約70%をカバーする24種類のTCR Vβの評価が可能です。これにより、レパトアの多様性の概略や、T細胞全体または特定のサブセット間での各TCR Vβの割合、そして特定のクローンの潜在的な拡大の可視化を提供します。

Vβの特異性が相互に排他的な組み合わせにグループ化できるという事実を利用し、3つのモノクローナル抗体と2つの蛍光色素のみを組み合わせた革新的な染色戦略を使用すると、同じチューブ内で3つのVβ発現を検出することが可能です。これまで、ある特定のTCR Vβ鎖を発現するT細胞の割合は、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して同定され、その分布を表計算プログラムに転送して、いわゆるクロノグラムとして可視化していました。Kaluza比較プロットを使用すると、別のソフトウェアにデータをエクスポートする必要なく、同等の可視化を実現することができます（図3）。

図3. CD3+ T細胞におけるTCR Vβレパトアのクロノグラム表示。正常な全血サンプルを、製造業者の指示に従ってIOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit *（製品番号 IM3497で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

比較プロットを用いたTCR Vβクロノグラムの作成

1. Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kitを使用して8本のチューブでサンプルを染色し、フローサイトメーターでデータを取得します。詳細なプロトコルと方法については、キットの使用説明書（beckman.com/techdocsで入手可能）を参照してください。
2. 結果として得られた8つのデータファイルをKaluzaで読み込み、解析したいT細胞サブセットを同定するためのゲーティング戦略を作成します。CD3+ T細胞のための典型的なゲーティング戦略を、図4に示します。Kaluzaでのプロットとゲートの作成方法について詳しくは、Kaluza IFU（製品番号C10986）を参照してください。





図4. チューブAのデータの例。白血球は側方散乱および前方散乱を使用してゲーティングされ、T細胞はCD3を使用しています。各チューブの３つのTCR Vβをドットプロットで表示し、FITCとPEの両方に結合したTCR Vβがダブルポジティブの象限の対角線上に現れます。正常な全血サンプルは、メーカーの指示に従ってIOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit *（製品番号 IM3497）で染色されました。プロットは例示のためのイメージです。



3. 新たに作成したゲーティング戦略を含むプロトコルを、ドラッグ＆ドロップ、またはコピー＋Paste Special（形式を選択して貼り付け）を使って、残りの7つのファイルにコピーします。これにより、すべてのゲートと四象限がすべてのデータセットで同じ名前を持つようになります。これは、以降の作業における可視化に重要です。
4. 8つのファイルすべてのCompositeを作成します。ナビゲーションを容易にするため、すべてのサンプルに対して生成されたプロットを1つのプロットシート上にカット＆ペーストすることも可能です。
5. オプション：T細胞サブセットの同定に使用されるゲートをリンクします。これにより、あるデータセットのゲートに加えられた変更が他のすべてのデータセットに適用されます。ゲートをリンクするには、ゲートの上にマウスを置いて右クリックし、ラジアルメニューにアクセスしてDataメニューに移動します。Link to Gatesハイパーリンクを選択します。リンクに適用できるゲートのリストがポップアップウィンドウに表示されます。現在のゲートにリンクしたいゲートを選択します。
6. 新しい比較プロットを作成し、y軸を% gatedに切り替えます。を選択し、Input Gateドロップダウンメニューから四象限の名前を選択することにより、Vβ鎖発現細胞を同定するために用いる四象限をシリーズとして追加します。
   
   
   

   図5：比較プロットの設定。 左側のDensityプロットは、Vβ 鎖を発現する細胞を同定するために使われる四象限を示しています。比較プロットには3つのデータ系列が含まれています。象限A++およびA-+がすでに適切に割り当てられています。正常な全血サンプルを、製造業者の指示に従ってIOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit *（製品番号 IM3497）で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

7. 比較プロットを右クリックし、ラジアルメニューのDisplay（表示）オプションを選択して、比較プロットをBar chart（棒グラフ）に切り替えます。
   
   
   

   図 6. 比較プロットの表示設定。正常な全血サンプルを、製造者の指示に従ってIOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit * (部品番号 IM3497)で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

8. ラベルと色を変更します。図2と同等の結果を得るために、以下の調整を行います。
   1. Coloringサブメニューにアクセスして、棒グラフの色を変更してください。カラーリングは、1番目、2番目、3番目の順に棒グラフに割り当てられ、すべてのデータセットで同様になります。
   2. Displayメニューにアクセスして、プロットの凡例を削除します。
   3. Displayメニューにアクセスして、Vβ鎖がゲートされた集団をTitleに入力します。
   4. Displayメニューにアクセスし、Use custom axisオプションを選択します。X軸のタイトルとしてTCR Vbetaを入力できます。
9. 対応するTCR Vβ鎖で棒グラフにラベルを付けるには、ラジアルメニューにアクセスし、Gates & Toolsメニューを選択します。Annotation（注釈）を選択します。プロット上でマウスをクリック＆ドラッグすると、テキストボックスが作成されます。ボックスが希望の大きさになったら、マウスボタンを離してください。テキストボックス上で右クリックし、ラジアルメニューのDataサブメニューにアクセスします。データフィールド内をクリックして注釈テキスト（この場合、特定の象限で検出されたTCR Vβ鎖）を入力します。テキストボックスをその象限に対応する棒グラフの上に移動させます。すべての棒グラフについて繰り返します。

図7. Annotation（注釈）機能を使用した棒グラフのラベル追加。 正常な全血サンプルを、製造業者の指示に従ってIOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit * (製品番号 IM3497)で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

Y軸スケールを操作したい場合は、ラジアルメニューにアクセスしてDataを選択します。Manual Y Axis Scaleのボックスをチェックし、希望するMinimum（最小値）とMaximum（最大値）を入力します。

図8. 比較プロットの手動Yスケール調整。正常な全血サンプルを、製造業者の指示に従い、IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit * (製品番号 IM3497)で染色しました。プロットは例示のためのイメージです。

Summary

Kaluzaの比較プロットは、データセットや入力集団間の発現量の違いを可視化するサポートをします。フローサイトメトリーデータ解析パッケージで折れ線グラフや棒グラフを利用できるため、ワークフローを効率化し、データのエクスポートや他のソフトウェアパッケージへの転送が不要になります。

参照

1. van der Geest KSM, Abdulahad WH, Horst G, et al. Quantifying Distribution of Flow Cytometric TCR-Vβ Usage with Economic Statistics. Turner SJ, ed. PLoS ONE. 2015;10(4):e0125373. doi:10.1371/journal.pone.0125373



* 研究用としてのみご利用いただけます。診断用途には使用しないでください。