Biomek i7ハイブリッド・加圧インテグレーションシステムによるPhreeリン脂質除去カートリッジを用いたビタミンD測定前処理の自動化

Kerstin Thurow¹, Heidi Fleischer¹, Anna Bach¹, Bhagya Wijayawardena², Miranda Kheradmand^2
1Center for Life Science Automation, University Rostock, Rostock, Germany
²Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, Indiana, United States

概要

ビタミンDは代謝における重要な成分であり、ビタミンＤの欠乏は、くる病や骨軟化症など複数の疾患につながります。そのため、研究者は、ビタミンDが代謝異常疾患の治療および予防に果たす役割の解明に関心を寄せています。このような研究では、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）を用いた血漿中ビタミンD定量測定が頻繁に行われますが、このメソッドに必要なサンプル前処理は、ハードワークなうえ、人的ミスにつながりやすいという問題があります。本アプリケーションノートでは、Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いたビタミンD測定用サンプル前処理の自動化の検討を行います。固相抽出によるサンプルクリーンアップ前の除タンパクには、Phreeリン脂質除去カートリッジを使用しました。

はじめに

血漿中、血清中の25（OH）D₂および25（OH）D₃の定量は、ビタミンの過剰摂取や欠乏の影響を理解する上で、ますます重要になってきています。マトリクスが複雑なため、ビタミンD解析のためのサンプル前処理は除タンパクや抽出ステップを含め広範囲におよびます。除タンパクやビタミンD結合タンパク質からの代謝産物の分離は、通常、遠心分離後に、アセトニトリル、メタノール、アセトニトリルとメタノール混合物、または2プロパノールを添加して行います[1]。生体試料のマトリクスには、タンパク質以外の成分も含まれますが、その中でも特にリン脂質（細胞膜の主成分）はイオン性が高く、質量分析計でのイオン化が妨げられる原因となります[2]。さらにリン脂質は移動相で濃縮され、分離不良や、ベースラインのノイズが増大するなど、カラムの寿命を縮める原因となります[3]。そのため、リン脂質の除去は、サンプル前処理において重要なステップです。リン脂質除去の主な方法は、強い陽イオン交換体を用いた固相抽出（SPE）か、SPEと液液抽出（LLE）を併用する方法です。しかし、これらの方法を実施すると、分析測定プロセスにさらに長い時間が必要になってしまいます。

サンプル前処理時間の短縮を目的に、様々なメーカーによって、除タンパク、リン脂質除去および抽出の利点を組み合わせて、プレート1枚またはカートリッジ1本でサンプル前処理が可能なサンプル前処理製品が開発されています[4]。本アプリケーションノートでは、Phreeリン脂質除去カートリッジを使用した固相抽出によるビタミンD測定用のサンプル前処理を自動化に関してご紹介します。

Figure 1. サンプル前処理ワークフロー。LC/MS分析を除く全てのステップを、周辺デバイスをインテグレーションしたBiomek i7ハイブリッドワークステーショ ンで行った。

方法

自動化の方法は、Phreeリン脂質除去カートリッジのメーカー（Phenomenex, Torrance, US）より公開されているプロトコルに基づいています。メソッドの開発と評価には、ブタ血清を使用しました（出典：Leibniz Institute for Farm Animal Biology, Dummerstorf, DE）。本検証に使用した物質は、Table 2～4に記載したメーカーから購入しました。自動サンプル処理には、Table 2に示すBiomek i7ハイブリッドのデッキレイアウトを使用しました。デッキは1度に144サンプルを処理するよう最適化しています。サンプルクリーンアップはBiomek i7 右側に組み込んだPositive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）で行いました。除タンパクに使用するアセトニトリル127 mLなど、大量の溶媒を自動的に補充できるリザーバ（amplius GmbH, Rostock, DE）を組み込みました。

サンプルは専用アダプタ （CELISCA, Rostock, DE） （Figure 4参照）を使用して1.5 mL Eppendorf safe-lock tube （Eppendorf, Hamburg, DE）に入れ、Biomek i7デッキに配置し、Table 1に従って処理しました。メソッドの検証は、25（OH）D2および 25（OH）D3濃度1 μg/mLの血清サンプルで行いました。抽出後、LC/TOF-MS（Agilent Technologies, Santa Clara, US）にサンプルを10 μL注入し、流速0.5 mL/minで分析しました。システムは内部標準法に従い、25（OH）D2および25（OH）D3含有量0.01～ 2 ppmの範囲でキャリブレーションを実施しました。

Figure 2. Phreeリン脂質除去カートリッジを使ったビタミンD測定のデッキレイアウト ー （1）チップボックス：1070 μL、230 μL、930 μL、（2）遠心分離機、（3）内部標準液（ISTD）、（4）アルミニウム製溶出バイアル瓶アダプタ、（5）サンプル、（6）Phree リン脂質除去カートリッジ、（7）Self-Refilling Quarter Reservoir
注：システムに組み込まれている遠心分離機は本プロトコルでは使用していません。

Figure 3. Biomek i7ハイブリッド・ビタミンD測定前処理自動化メソッド ー Phree リン脂質除去カートリッジを使用したサンプルクリーンアップの自動化

Figure 4. （a）サンプルバイアル用のストレージ（CELISCA, Rostock, DE）、（b）Positive Pressure Extractor（amplius GmbH, Rostock, DE）

Table 1. Phreeカートリッジを使用したビタミンD測定用のサンプル前処理プロトコル

結果

測定は、25（OH）D₂ および25（OH）D₃含有量0.01 ppm ～ 2 ppmの範囲でキャリブレーションしました（Figure 5参照）。25（OH）D₂の回収率は90.95%-106.21%、25（OH）D₃は94.61%-115.50 %でした。回収率が高いことから、リン脂質が最適に除去されたことがわかります。10サンプルで測定されたデータから計算した変動係数（CV）は25（OH）D₂で4.36%、25（OH）D₃で5.1%でした。実験間差は、10サンプルで5日間繰り返し測定を行い検証しました。その結果、CV は、25（OH）D₂で2.68% ～8.36%、25（OH）D₃で1.69-5.51%となりました。
検出限界（LOD）と定量限界（LOQ）については、25（OH）D₂でLOD＝5.91 ng/mL、LOQ＝12.54 ng/mLで、25（OH）D₃でLOD＝26 ng/mL、LOQ＝73.2 ng/mLでした。
LC/MS/MSシステムを最適化すれば、検出限界はさらに改善することが可能です。得られた結果は、除タンパク質を遠心分離で行う従来法と同等でした。

まとめ

本アプリケーションノートでは、LC/MSによるビタミンD測定のためのサンプル処理を、Biomek i7ハイブリッドワークステーションで自動化しました。Phreeリン脂質除去カートリッジを使用して除タンパクとサンプルクリーンアップを同時に行うことで、処理工程が減り、所要時間も短縮されました。回収率の高さから、リン脂質が効果的に除去されたことが示されています。
本自動化ワークフローで得られた低いCV値（2～9%）から、再現性の高さが示されました。

Figure 5. （a）25（OH）D₂ および（b）25（OH）D₃のキャリブレーション

参考文献

1. Ding S, Schoenmakers I, Jones K, et al. Quantitative determination of vitamin D metabolites in plasma using UHPLC-MS/MS. Anal Bioanal Chem 2010;378: 779-789.
2. Pucci V, Di Palma S, Alfieri A, et al. A novel strategy for reducing phospholipids-based matrix effect in LC-ESI-MS bioanalysis by means of Hybrid SPE. J Pharm Biomed Anal 2009;50 （5） 867-871.
3. Tulipani S, Llorach R, Urpi-Sarda M, et al. Comparative analysis of sample preparation methods to handle the complexity of the blood fluid metabolome: When less is more. Anal Chem 2013;85（1）: 341-348.
4. Huq S, Pike Safan E, Rapid and Effective Cleanup of Vitamin D2 and D3 from Human Plasma using PhreeTM Phospholipid Removal Plates and Kinetex®Core-Shell HPLC/UHPLC Columns. Application Note TN0061, Phenomenex Inc., 2013.

使用した機器・試薬・消耗品など

Table 2. 使用した機器³

Table 3. 使用した試薬³

Table 4. 使用した消耗品³

Biomek i-Series自動化ワークステーションは、疾患等の診断での使用を意図しておらず、検証も行っておりません。

本プロトコルはデモンストレーションのみを目的としており、ベックマン・コールターによる検証は行っておりません。本プロトコルに関して、ベックマン・コールターは、明示または暗示を問わず、いかなる保証を行うものではありません。これには特定目的への適合性、または商品性、あるいはプロトコルの特許不権侵害の保証を含みますが、これに限定するものではなく、その他一切の保証を明示的に排除いたします。このメソッドの使用はお客様の責任のみにおいて行われるものとし、ベックマン・コールターは一切の責任を負いません。また、疾患等の診断での使用を意図しておらず、検証も行っておりません。

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