Biomek i7ハイブリッドワークステーションによる加圧式固相抽出を用いたカンナビノイド分析の自動化

Anna Bach, Heidi Fleischer, Kerstin Thurow, Center for Life Science Automation, University Rostock, Rostock, Germany Bhagya Wijayawardena, Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis (IN), United States

要旨

テトラヒドロカンナビノール[THC：(-)-Δ⁹-trans-tetrahydrocannabinol]は、大麻に含まれる生理活性物質で、最も広く知られている幻覚剤の一つです。カンナビノイドが治療薬として使えるかに関する科学的研究が、何年にもわたって続けられています。最もよく使われるカンナビノイドの分析方法は、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）ですがLC/MSでの分析には、時間のかかるサンプル前処理が必要です。サンプル前処理を自動化すれば、再現性が向上するだけでなく、人為的操作ミスやマニュアル操作を減らすことも可能です。本アプリケーションノートでは、Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いたTHC分析用サンプル前処理の自動化を検証します。

はじめに

大麻（Cannabis）は世界で最も有名な薬物の一つで、アサ科アサ属の植物である大麻草から作られます。大麻の主な精神活性成分はテトラヒドロカンナビノール[THC：(-)-Δ⁹-trans-tetrahydrocannabinol]で、その不活性な前駆体、テトラヒドロカンナビノール酸（THCA）として天然に存在します。この不活性な前駆体が加熱や乾燥によって脱炭酸されると、精神活性剤であるTHCに変換されます。カンナビノイドはしびれ効果や陶酔作用を持つ物質群で[Figure 1（A）]、伝統医学では、鎮痛剤として長年使用されています。

近年、大麻には様々な疾患治療の可能性があり、大きな注目を集めています。合成鎮痛薬であるオピオイドと違い、カンナビノイドは、過剰に摂取した場合でも、生命を脅かすような呼吸抑制や、感染症菌に対する防御機能の低下につながることはありません。そのため、THCはドロナビノールとして、細菌毒性による嘔吐の緩和や、エイズ患者の体重減少を伴う食欲不振の治療に用いられています²。また、（カンナビノイドを含有する）ナビキシモルスは、多発性硬化症患者のけいれん発作の軽減に有益性があるとの提言がなされています。少なく算出したとしても、約1億9200万人（世界人口のおよそ3.9%）が大麻を医療用麻薬として使用しています²。

テトラヒドロカンナビノール[THC：(-)-Δ⁹-trans-tetrahydrocannabinol]は、大麻に含まれる活性化学物質です。市場での大麻成分含有製品の増加を受け、大麻の摂取量と作用との関係を明らかにする研究の必要性が高まる中、Δ⁹-THCおよびその代謝物の分析測定の重要性も益々高まってきています。簡易検査では唾液や尿に含まれる大麻成分の定量はできません。唾液、血液、尿、呼気を使用して正確な検査を行うには、LC/MS/MS³またはGC/MS⁴で詳しく分析する必要があります。

Figure 1. 典型的なカンナビノイド

血清または血漿からのTHCとその代謝物の分析測定には、作業に時間を要するサンプル前処理が必要になります。これには通常、除タンパクや抽出プロセスが含まれます。分析測定の前に、溶媒置換のためにエバポレーションによる濃縮プロセスが必要となるケースもあります。本アプリケーションノートでは、Biomek i7ハイブリッドワークステーションによる固相抽出を用いたカンナビノイド分析のサンプル前処理法の自動化を開発しました。

材料と方法

固相抽出法で、血清中のΔ⁹-THC- D₃, 11-OH-Δ⁹-THCおよび11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THC測定を行いました。メソッドの開発と検証には、ブタ血清を使用しました。試験手順で使用した試薬類は、複数のベンダーから購入し、それぞれストック溶液を作製しました（Table 3：使用した試薬参照）。典型的な除タンパクとして、Strata^ⓇX-C マイクロエリューション 96well SPEプレート（Phenomenex, Torrance, USA）を使った固相抽出にて行いました。エバポレーションによる濃縮や再溶液調製のステップを追加する必要もなく、微量の溶出物から高い濃度の目的物質が得られました。

サンプル前処理プロトコルの詳細はTable 1に示すとおりですが、簡単にまとめると、次のようになります。血清サンプルを1.5 mL Eppendorf safe-lock tube（Eppendorf, Hamburg, DE）に入れたのち、メタノールと硫酸亜鉛を添加し、タンパク質を沈殿させ、内部標準液を血清サンプルに添加しました。Strata^ⓇX-C マイクロエリューションプレート（Phenomenex, Torrance, USA）を使用し、組み込んだPositive Pressure Unit（amplius GmbH, Rostock, DE）で固相抽出を行いました。最終サンプル10 μLをLC/Q-TOF-MS（Agilent Technologies, Santa Clara, USA）に注入し、流速0.5 mL/minで分析しました。システムは内部標準法に従い、0.2～100 ng/mLの範囲でキャリブレーションを実施しました。

Table 1. 加圧式固相抽出を用いたTHC 分析のためのサンプル処理プロトコル

ワークフローの自動化を実現するため、遠心機（VSpin, Agilent Technologies, Santa Clara, USA; Biomek左側）、Positive Pressure Unit（amplius, GmbH, Rostock, DE; Biomek右側）、Self-Refilling Quarter Reservoir（amplius GmbH, Rostock, DE; オンデッキ）などのデバイスをBiomek i7ハイブリッドワークステーションにインテグレーションしました（Figure 2）。適切な遠心分離を担保するため、遠心機の近くに適切なバランス用プレートを配置しました。Biomekに沈殿用バイアルを24本設置できるよう、専用のアダプタを開発しました（Figure ３参照）。デッキレイアウトは最大96サンプルを同時処理できるよう最適化しました（Figure 2）。溶液の蒸発を最小に抑えるため、Self-Refilling Quarter Reservoir（amplius GmbH, Rostock, DE）をデッキに組み込み、必要量の溶液を自動充填できるようにしました（Figure 4,5）。

Figure 2. THC分析のためのデッキレイアウト‐（1）チップボックス、（2）カウンターバランス、（3）遠心機、（4）内部標準液および希釈液用アルミニウム製バイアル瓶アダプタ、（5）除タンパク用バイアル、（6）Eppendorfバイアル中の血清サンプル、（7）Self-Refilling Quarter Reservoir、（8）追加の溶媒リザーバ、（9）Positive Pressure Processor、（10）3D Tilting ALP、（11）アルミニウム製アダプタに入った内部標準液用のスタティックペルチェALP

Figure 3. （A） サンプルバイアル用ストレージアダプタ（CELISCA, Rostock, DE）、（B）VSpin遠心機に沈殿用バイアルを24本設置するための専用アダプタ （CELISCA, Rostock, DE）、（C）Positive Pressure Unit（amplius GmbH, Rostock, DE）、（D）除タンパクバイアル用ストレージアダプタ（CELISCA, Rostock, DE）、（E）アルミニウム製アダプタ（CELISCA, Rostock, DE）、（F）Self-Refilling Quarter Reservoir（amplius GmbH, Rostock, DE）

Figure 4. Biomek i7ハイブリッド・カンナビノイド測定前処理自動化メソッド‐除タンパクに遠心分離機を使用

Figure 5. THC分析用のBiomek i7メソッド‐SPEによるサンプルクリーンアップ

結果

Figure 6は、Δ⁹-THC- D₃、11-Hydroxy-Δ⁹-THCおよび11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THCのキャリブレーション曲線です。本自動化メソッドでの回収率は、96.41% ～104.15%となりました。再現性は12サンプルで測定されたデータから算出して検討しました。その結果、最大変動係数（CV） は、0.53%でした。ラボ内再現性は、10サンプルでのサンプル前処理を5日間繰り返して測定を行い検証しました。その結果、CVは0.44% ～3.11%でした。検出限界（メソッド）は、Δ⁹-THC-D₃で0.625 ng/mL、11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THCで 3.593 ng/mLでした。11-Hydroxy-Δ⁹-THCの検出限界は1.511 ng/mLでした。定量限界（メソッド）は、Δ⁹-THC- D₃で0.704 ng/mL、11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THCで3.957 ng/mL、11-Hydroxy-Δ⁹-THCで1.38 ng/mLでした。

Figure 6. （A）Δ⁹-THC-D3、（B）11-Hydroxy-Δ⁹-THC、（C）11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THCのキャリブレーション曲線

おわりに

Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いてカンナビノイドサンプル前処理を自動化するワークフローを開発しました。開発した自動化ワークフローは、優れた再現性を示しました。本ワークフローで使用したカンナビノイド3種類(Δ⁹-THC- D、11-Hydroxy-Δ⁹-THC、11-nor-9-Carboxy-Δ⁹-THC)全てで、レプリケート間の変動は0.53%以下と低い数値を示しました。複数日にわたる再現性については、3種類の検出対象物質全てで、CV値は3.11%以下でした。

参考文献

1. Grotenhermen, F.: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Cannabinoids, Clinical Pharmacokinetics 42(4), 327-360 (2003).
2. Whiting, P., Wolff, R., Deshpande, S.: Cannabinoids for Medical Use: A Systematic Review and Meta-analysis, Journal American Medical Association 313(24), 2456-2473 (2015).
3. Teixeira, H., Verstraete, A., Proença, P., Monsanto, P., Vieira, D. N.: Validated method for the simultaneous determination of Δ 9-THC and Δ 9-THC-COOH in oral fluid, urine and whole blood using solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry with electrospray ionization. Forensic Science International 170(2–3), 148-155 (2007).
4. Yonamine, M., Tawil, N., de Moraes Moreau, R. L., A., Silva O.: Solid-phase micro-extraction–gas chromatography–mass spectrometry and headspace-gas chromatography of tetrahydrocannabinol, amphetamine, methamphetamine, cocaine and ethanol in saliva samples, Journal of Chromatography B 789(1), 73-78 (2003).

材料

使用した機器

Table 2. 使用した機器

使用した試薬

Table 3. 使用した試薬

使用した消耗品

Table 4. 使用した消耗品

再利用可能な消耗品およびアダプタ

Table 5. 再利用可能な消耗品およびアダプタ

Biomek i-Series自動化ワークステーションは、疾患等の診断での使用を意図しておらず、検証も行っておりません。

本プロトコルはデモンストレーションのみを目的としており、ベックマン・コールターによる検証は行っておりません。本プロトコルに関して、ベックマン・コールターは、明示または暗示を問わず、いかなる保証を行うものではありません。これには特定目的への適合性、または商品性、あるいはプロトコルの特許不権侵害の保証を含みますが、これに限定するものではなく、その他一切の保証を明示的に排除いたします。このメソッドの使用はお客様の責任のみにおいて行われるものとし、ベックマン・コールターは一切の責任を負いません。

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